微生物快速檢測方法ppt課件

微生物快速檢測方法簡介 常見微生物檢測項目 常規(guī)微生物項目細菌總數(shù) 大腸菌群 大腸桿菌 霉菌及酵母菌致病微生物項目沙門氏菌 李斯特菌 金黃色葡萄球菌 大腸桿菌O157 H7 彎曲桿菌 致病弧菌 副溶血弧菌 志賀氏菌 假單胞菌等 傳統(tǒng)計數(shù)改良法1 培養(yǎng)膜法2 螺旋平板計數(shù)法 螺旋接種儀 菌落計數(shù)3 濾膜法 常用于一些可過濾樣品的檢測快速檢測的新方法1 ATP生物熒光法2 電阻抗法3 顏色變化4 流式細胞技術(shù)及激光掃描技術(shù)5 其它 熱量法 放射測量法 常規(guī)微生物檢測方法 培養(yǎng)膜法 快速檢測紙片技術(shù) 原理二片塑料膜構(gòu)成 上薄為蓋 下厚為培養(yǎng)基 操作方法 檢樣稀釋 取1ml滴于下膜正中央 蓋上膜 擴展器壓成20cm2圓圈 37 培養(yǎng)24h 計數(shù) 顯色的斑點 培養(yǎng)膜法 快速檢測紙片技術(shù) 優(yōu)點 可節(jié)約玻璃儀器 培養(yǎng)基 可節(jié)省培養(yǎng)基等試劑的配置滅菌和玻璃儀器滅菌和清洗的時間 人力和費用 因為有顯色劑和小方格 計數(shù)方便 節(jié)約稀釋的繁瑣動作 可快速測試致病菌 節(jié)省大量的實驗步驟 缺點成本比傳統(tǒng)方法要稍高些 測試細菌總數(shù) 大腸菌群 霉菌和酵母菌時不能節(jié)約培養(yǎng)時間 培養(yǎng)膜法 快速檢測紙片技術(shù) 應用細菌總數(shù)測試片中含有一種紅色指示染劑 使所有菌落易認別計數(shù) 大腸菌群測試片中含有指示劑 使菌落為紅色 且有氣泡產(chǎn)生 大腸桿菌指示劑可使所有菌落為紅色 并可留住大腸桿菌產(chǎn)生的氣泡 24小時可確定大腸桿菌數(shù) 霉菌和酵母菌計數(shù)測試片中加入的抗生素 可以抑制細菌生長 指示劑使酵母菌易認別計數(shù) 霉菌可產(chǎn)生特有的色澤 金黃色葡萄球菌使用了具有熱穩(wěn)定的核酸酶反應片 核酸酶反應產(chǎn)生的粉紅色環(huán)帶色圍著一個紅色或蘭色菌落即為金黃色葡萄球菌 26小時可確認結(jié)果 培養(yǎng)膜法 快速檢測紙片技術(shù) 螺旋平板法 DWS螺旋平板接種儀 自動菌落計數(shù)儀 原理樣品制備的菌懸液在瓊脂表面形成阿基米德螺旋型軌跡 當用于分液的空心針從平板中心移向邊緣時 菌液體積減少 注入的體積和瓊脂半徑間存在指數(shù)關(guān)系 培養(yǎng)時菌落沿注液線生長 用一計數(shù)的方格來校準與瓊脂表面不同區(qū)域有關(guān)的樣品量 計數(shù)每個區(qū)域的已知菌落數(shù) 在計算細菌濃度 螺旋平板法 平皿旋轉(zhuǎn) 接種針往外移動同時自動將樣品稀釋1000倍 阿基米德螺旋型軌跡 螺旋平板法 優(yōu)點與傳統(tǒng)方法相比 無需稀釋梯度 每個梯度倒2個平板 節(jié)省了大量人力物力 缺點檢測時間并沒有縮短 菌落總數(shù)仍需要培養(yǎng)48小時 需要配合自動菌落計數(shù)儀 否則人工計數(shù)更麻煩 螺旋平板法 濾膜法 濾膜法常用于可過濾樣品的微生物檢測 優(yōu)點靈敏度增大 菌落無擴散情況 便于計數(shù) 缺點需要額外的支出購買真空泵 多聯(lián)支架及一次性濾膜 如果抽濾過程空氣潔凈度不夠 有可能造成二次污染 尤其是對菌數(shù)要求特別嚴格的產(chǎn)品 如啤酒 澄清果汁 桶裝飲用水等 ATP生物熒光法 原理ATP 螢光素 螢光素酶 O2 AMP Ppi CO2 氧化螢光素 光應用用于食品生產(chǎn)線和管道進行快速清潔程度檢測 用于水質(zhì)檢測 改良后用于食品的商業(yè)無菌檢測或終產(chǎn)品檢驗 10秒獲得結(jié)果 涂抹采樣 混合 震蕩5s 檢測 表面清潔度 水質(zhì)檢測 ATP生物熒光法 ATP法檢測成品的優(yōu)缺點優(yōu)點 大大縮短庫存時間 減少物流壓力和成本 缺點 ATP方法需要消耗大量的較昂貴的試劑 對儀器的清洗保養(yǎng)要求特別高 另外 有存在假陰性的可能 ATP生物熒光法 電阻抗法測定細菌總數(shù) 原理供細菌生長的液體培養(yǎng)基是電的良導體 在特制的測量管底部裝入電極插頭 即可對接種生長的培養(yǎng)基的阻抗變化進行檢測 阻抗變化的產(chǎn)生是由于微生物生長過程中的新陳代謝使培養(yǎng)基中的大分子營養(yǎng)物質(zhì) 糖 脂類 蛋白質(zhì)等 被分解成小分子代謝物 即較小的帶電離子 乳酸鹽 醋酸鹽 重碳酸或氨等 這些代謝產(chǎn)物的出現(xiàn)和聚集 增強了培養(yǎng)基的導電性能 從而降低了其阻抗值 M R0 RT R0 100 其中R0表示開始時培養(yǎng)基的阻抗值RT表示任意時刻培養(yǎng)基的阻抗值M表示培養(yǎng)基電阻減少的百分數(shù) 電阻越小細菌活動越多 在一定范圍內(nèi) 菌落形成單位的對數(shù)Log CFU 與IDT 阻抗檢測時間 呈直線關(guān)系 電阻抗法測定細菌總數(shù) 優(yōu)缺點 電阻抗法較省力 樣品細菌數(shù)在4 18小時內(nèi)出結(jié)果 但對于菌數(shù)太低的不好 樣品中還不能用防腐劑 否則結(jié)果是亂七八糟的 電阻抗法制作標準曲線過程中工作量較大 但以后的檢測簡便的多 不需要一系列稀釋 只需樣品1ml 培養(yǎng)基9ml 測量管一只 電阻抗法測定細菌總數(shù) 通過顏色變化檢測 微生物生長導致培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化 由光學檢測器檢測底部瓊脂層的顏色變化 記錄達到突變點的時間 與阻抗法類似 可以實現(xiàn)快速檢測 缺點 需要購買原廠的預裝培養(yǎng)基 應用范圍受限制 成本高昂 梅里埃的BacT Alert微生物檢測儀 基于微生物生成產(chǎn)生CO2的原理 CO2積累越多 底部的CO2傳感器變黃 由LED發(fā)射一束光至底部 探頭檢測反射光的強度 光強度與微生物數(shù)量有一定關(guān)系 流式細胞技術(shù) 原理液體樣品流過儀器中的激光照射的流動池 當微生物流過顯微鏡聚焦的流動池時就能被自動地檢測到 特點檢測方法與使用的儀器有高度的特異性 所以應遵循生產(chǎn)廠商提供的方法 FOSS公司BactoScanFC牛奶中總菌數(shù)快速檢測儀采用流式細胞原理 對微生物進行核酸染色 用流式細胞技術(shù)進行計數(shù) 優(yōu)點 速度快 50 150樣品 小時 缺點 死活細胞一起檢測 消耗成本較高 儀器比較難保養(yǎng) 靈敏度不夠高 適合牛奶企業(yè)檢測原奶中細菌總數(shù) 流式細胞技術(shù) 美國Chemunex公司微生物快速檢測系統(tǒng)將流式細胞技術(shù)與活細胞熒光探針標記及激光掃描技術(shù)相結(jié)合 推出的最新一代的速度更快的Bactiflow以及更高端的ScanRDI和D count微生物快速檢測儀 其最大的特點是只檢測活細胞數(shù) 速度極快 處理量大 檢測步驟 1 過濾 2 標記 直接對活細胞和酵母進行標記 3 激光掃描 流式細胞技術(shù) 三種型號的差異 利用細菌生長時產(chǎn)生熱量的原理設計而成 微生物在生長和代謝的過程中 能產(chǎn)生大量的代謝熱 由于各種微生物的代謝產(chǎn)物熱效應不同 因此可顯示出特異性的熱效應曲線圖 熱效應曲線圖的形成 是由于培養(yǎng)基含有多種成分 微生物則產(chǎn)生多種不同的代謝產(chǎn)物 以此表現(xiàn)出的熱效應為多個曲線峰 如為單一營養(yǎng)成分 則只有一個峰出現(xiàn) 在細菌生長的過程中 用微量量熱計測量產(chǎn)熱量等熱數(shù)據(jù) 經(jīng)計算機處理 繪制成以產(chǎn)熱量對比時間組成的熱曲線圖 以此推斷細菌存在數(shù)量 微量量熱法 發(fā)射測量法 利用細菌在代謝碳水化合物時產(chǎn)生CO2的原理 把微量的放射性標記引入葡萄糖或其他糖類分子中 細菌生長時 糖被利用并放出標記的CO2 將生成的放射性標記CO2從培養(yǎng)裝置中導出或用化學法吸收后 利用專用的放射測量儀來測定放射性CO2 放射量與菌數(shù)成正比 致病菌快速檢測方法 顯色培養(yǎng)基法 技術(shù)成熟 產(chǎn)品很多 免疫學方法 產(chǎn)品最多 特異性和敏感性都很高 但有假陽性存在 陽性結(jié)果需要確認 通常的原理有EIA ELISA GLISA 熒光酶免 免疫磁分離等方法 分子生物學方法 以基因探針檢測法和PCR法為主 基因芯片 顯色培養(yǎng)基法 原理在選擇性培養(yǎng)基的基礎上經(jīng)過改良 利用細菌特有的生理生化反應 使培養(yǎng)基中的指示劑產(chǎn)生顏色變化 以將目標菌與其他菌區(qū)別開來 酶聯(lián)免疫技術(shù) mini Vidas全自動免疫分析儀 利用熒光分析技術(shù)通過固相吸附器 用已知抗體來捕捉目標生物體 然后以帶熒光的酶聯(lián)抗體再次結(jié)合 經(jīng)充分沖洗 通過激發(fā)光源檢測 即能自動讀出發(fā)光的陽性標本 優(yōu)點是檢測靈敏度高 速度快 可以在48小時的時間內(nèi)快速鑒定沙門氏菌 大腸桿菌O157 H7 單核李斯特菌 空腸彎曲桿菌和葡萄球菌腸毒素等 分子生物學方法 基因探針法及PCR方法在國外已經(jīng)有相當成熟的表現(xiàn) 有普通PCR 熒光PCR 實時熒光PCR 定量PCR 等多種方法 基因探針法一般也需要增菌 然后加探針試劑雜交 然后在熒光顯微鏡熒光檢測器下獲得結(jié)果 PCR方法一般不需增菌