熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析ppt課件.ppt

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析與常見(jiàn)問(wèn)題解決,技術(shù)支持黃志,內(nèi)容,LifeTechnologies公司定量PCR儀產(chǎn)品概覽熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題的解決,AB熒光定量PCR儀的發(fā)展歷史,1995世界上第一臺(tái)定量PCR儀-7700型誕生1997推出面向醫(yī)療系統(tǒng)用戶(hù)的5700型定量PCR儀2000推出7900型384孔定量PCR儀2001推出7900型96孔定量PCR儀2001推出7000型96孔定量PCR儀2004獲得定量PCR儀專(zhuān)利確立AB在業(yè)界內(nèi)的領(lǐng)先地位2004第5代定量PCR儀73007500型誕生第6代定量PCR儀StepOne和StepOnePlus問(wèn)世第7代定量PCR儀ViiA7發(fā)布最新熒光定量PCR儀QuantStudio12KFlex發(fā)布,AB熒光定量PCR儀家族,第一、二代77005700,第三、四代70007900,第五代73007500,第六代stepone/plus,第七代ViiA7,最新型QuantStudio,熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,熒光PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析流程,查驗(yàn)擴(kuò)增曲線(xiàn),檢查/調(diào)整基線(xiàn),檢查/調(diào)整閾值,檢查NTC,檢查陽(yáng)性對(duì)照,檢查陰性對(duì)照,分析樣品數(shù)據(jù),基線(xiàn)與閾值線(xiàn)的設(shè)置,一般情況下選擇軟件默認(rèn)的“自動(dòng)設(shè)置”；特殊情況下或必要時(shí)，可以手動(dòng)設(shè)置；手動(dòng)設(shè)置的原則請(qǐng)查詢(xún)“DataAnalysisontheABIPRISM7700SequenceDetectionSystem:SettingBaselinesandThresholds:Guide:RevA”，文件號(hào)：4370923。,基線(xiàn)的設(shè)定,系統(tǒng)背景信號(hào)，在扣除背景過(guò)程中影響擴(kuò)增信號(hào)的數(shù)值，最終影響Ct值。默認(rèn)自動(dòng)分析，比如設(shè)定在“3-15”個(gè)循環(huán)。手動(dòng)設(shè)置時(shí)要避開(kāi)前期的熒光波動(dòng)與后期的擴(kuò)增信號(hào)。必要時(shí)可以獨(dú)立設(shè)定制定樣品的基線(xiàn)取值范圍（V2.0）。,閾值線(xiàn)的設(shè)定,默認(rèn)設(shè)定為同類(lèi)擴(kuò)增基線(xiàn)信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，反映擴(kuò)增信號(hào)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的意義。不同擴(kuò)增子應(yīng)當(dāng)獨(dú)立設(shè)定閾值線(xiàn)。手動(dòng)設(shè)置在“指數(shù)擴(kuò)增期”，避開(kāi)前期的背景熒光波動(dòng)與后期的非指數(shù)擴(kuò)增及陰性對(duì)照最高點(diǎn)。對(duì)于絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)，閾值線(xiàn)設(shè)定在使得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的決定系數(shù)值（R2）接近1，斜率接近-3.32的地方。對(duì)于無(wú)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的實(shí)驗(yàn)，閾值線(xiàn)設(shè)定在使得重復(fù)樣品Ct值差異最小的位置。閾值線(xiàn)設(shè)定在保障靈敏度均為最佳的位置,實(shí)驗(yàn)結(jié)果的考評(píng)指標(biāo),定性實(shí)驗(yàn)：是否為顯著的“S型”擴(kuò)增曲線(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)的“高度”-表示體現(xiàn)擴(kuò)增性能的“強(qiáng)度”陽(yáng)性對(duì)照的Ct值是否在“預(yù)期”的位置：過(guò)早污染或加樣錯(cuò)誤過(guò)晚存在抑制劑或擴(kuò)增體系條件不佳陰性對(duì)照是否報(bào)告Ct值污染、探針特異性差、閾值線(xiàn)設(shè)定過(guò)低,絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率或擴(kuò)增效率標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的決定系數(shù)值：R2檢測(cè)樣品是否偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)重復(fù)樣品Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差,絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)效果的評(píng)估,CT=klgX0+b,CT2CT1=（klgX02+b）（klgX01+b）,CT2CT1=k(lgX02lgX01),CT2CT1=klg(X02/X01),當(dāng)擴(kuò)增效率為100時(shí)，K=-3.32，若CT相差1，則兩個(gè)樣品的濃度差異為：,lg(X02/X01)=(CT2CT1)/k,當(dāng)擴(kuò)增效率為100時(shí)，K=-3.32，兩個(gè)樣品的濃度差異為10倍，則CT差異為：,CT值差與模板量差的關(guān)系,濃度增加1倍，CT值減小1個(gè)單位,濃度增加10倍，CT值減小3.3個(gè)單位,熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題,病原體核酸檢測(cè)效果的主要影響因素,樣品采集和儲(chǔ)運(yùn),核酸抽提,核酸定量檢測(cè),采樣部位、保存液、凍融,導(dǎo)致巨大差別的因素,導(dǎo)致一般差別的因素,交叉污染、抑制劑、病毒裂解,引物、探針設(shè)計(jì)/合成質(zhì)量核酸的純度和完整性預(yù)混液的質(zhì)量,樣品量,樣品量、回收率,儀器、循環(huán)條件,實(shí)驗(yàn)污染反應(yīng)試劑質(zhì)量問(wèn)題未正確密封而導(dǎo)致的試劑蒸發(fā)錯(cuò)誤的熒光染料設(shè)置錯(cuò)誤的反應(yīng)程序設(shè)置使用錯(cuò)誤的耗材熒光污染儀器硬件問(wèn)題,導(dǎo)致異常實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的常見(jiàn)原因:,兩種容易混淆的陰性對(duì)照,無(wú)模板的陰性對(duì)照在反應(yīng)體系中不加入核酸模板，而以水為替代的對(duì)照目的：監(jiān)控配制反應(yīng)體系的試劑是否存在污染。陰性樣品的對(duì)照在樣品制備過(guò)程中，加入已知的陰性樣品（或水），并將提取物作為模板加入反應(yīng)體系，參與整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程。目的：監(jiān)控整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中是否存在污染。,故障排除時(shí)提供有用信息的軟件界面,原始熒光組分曲線(xiàn)-v2.0,擴(kuò)增曲線(xiàn)-v2.0,標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)-v2.0,原始多通道熒光信號(hào)-v2.0,原始多通道熒光信號(hào)-v2.0,質(zhì)控報(bào)告-V2.0,理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,案例1:是否存在擴(kuò)增？,一些形狀和正常的擴(kuò)增曲線(xiàn)有區(qū)別的曲線(xiàn)，該如何判斷呢？,正常的擴(kuò)增曲線(xiàn),平臺(tái)期很低,可疑的擴(kuò)增曲線(xiàn),這些曲線(xiàn)都有典型的指數(shù)增長(zhǎng)期，而且和其他的曲線(xiàn)平行（雖然比較短）。,如何判斷它們是真正的擴(kuò)增？,同時(shí)也具有特征性的三個(gè)增長(zhǎng)階段。,如何判斷它們是真正的擴(kuò)增？,可能是目標(biāo)模板的濃度太低。通常如果模板的起始濃度太低,反應(yīng)體系會(huì)形成大量的引物二聚體。大量引物二聚體的形成使得引物很快消耗完，從而造成擴(kuò)增曲線(xiàn)的平臺(tái)期很低。,是什么原因造成平臺(tái)期很低?,案例2:是否存在擴(kuò)增？,?,如何判斷它們是否存在擴(kuò)增？,首先，和同一反應(yīng)中的其他擴(kuò)增曲線(xiàn)相比，這些曲線(xiàn)的形狀不相同。,同時(shí)，這些曲線(xiàn)都沒(méi)有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期。,如何判斷它們是否存在擴(kuò)增？,其次，看Y軸的數(shù)值。這些“可疑”曲線(xiàn)的指數(shù)增長(zhǎng)期范圍常常是落在1e-2的范圍內(nèi)。,對(duì)數(shù)圖,如何判斷它們是否存在擴(kuò)增？,最后，查閱線(xiàn)性圖：曲線(xiàn)一直沒(méi)有指數(shù)上升的趨勢(shì)，提示不存在擴(kuò)增。輕微的熒光增長(zhǎng)可能來(lái)源于探針的降解。,如何判斷它們是否存在擴(kuò)增？,案例3:是否存在擴(kuò)增？,右側(cè)的曲線(xiàn)形狀和擴(kuò)增曲線(xiàn)很相似，但是曲線(xiàn)不光滑。,切換到線(xiàn)性圖，可以看到曲線(xiàn)有一定的上升。,如何判斷它們是否存在擴(kuò)增？,分析,這些樣品在反應(yīng)的最后階段才開(kāi)始擴(kuò)增，平臺(tái)期很接近背景。這些樣品的擴(kuò)增曲線(xiàn)出現(xiàn)了指數(shù)擴(kuò)增的區(qū)段雖然我們可以認(rèn)為這些樣品是臨界陽(yáng)性，但是對(duì)這些樣品的定量結(jié)果都是不太準(zhǔn)確的。形成這類(lèi)曲線(xiàn)的原因可能是模板的質(zhì)量差(RT/PCR抑制物;模板濃度低)，也可能是引物探針的設(shè)計(jì)問(wèn)題。試劑原因如果使用的試劑背景信號(hào)太強(qiáng)，熒光的增長(zhǎng)將會(huì)很小，導(dǎo)致擴(kuò)增曲線(xiàn)的指數(shù)增長(zhǎng)期會(huì)變得很短，或者沒(méi)有。熒光信號(hào)差的試劑也會(huì)有同樣的問(wèn)題。,總結(jié)：遵循擴(kuò)增曲線(xiàn)形態(tài)第一，Ct值第二的判讀原則。,查看MultiComponentPlot：是否有正常的陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)查看擴(kuò)增曲線(xiàn)的形狀：是否有明顯擴(kuò)增階段（指數(shù)增長(zhǎng)期）?指數(shù)圖下擴(kuò)增曲線(xiàn)間是否平行