液相色譜條件的分析和建立

.,液相色譜條件的分析和建立主講人:李效寬日期:2010年11月地點(diǎn)：武漢,.,.,HPLC分離原理,樣品組分在流動(dòng)相和固定相之間進(jìn)行分配，由于不同組分與固定相之間的交互作用能力(吸附.分配.離子交換.分子尺寸等)不同，使得不同組分在色譜柱上的移動(dòng)速率不一樣，從而產(chǎn)生色譜分離。(必要條件),.,不同類型樣品的方法選擇,.,色譜柱的選擇,根據(jù)分離方式分類(1)正相色譜：SiO2；CN；NH2(2)反相色譜：C18；C4；C8；CN；NH2；苯基(3)離子交換色譜：陽(yáng)離子官能團(tuán)：SO3H磺酸基、COOH羧基等陰離子官能團(tuán)：R4N季銨基、-氨基等(4)凝膠色譜：水溶性凝膠過(guò)濾（GFC）；油溶性凝膠滲透（GPC）(5)其它類型：手性柱等,.,1.填料基質(zhì)：硅膠、氧化鋁、聚苯乙烯等2.鍵合相：C4、C8、C18、苯基、氨基、氰基等3.孔徑：60-100A分子量20004.粒徑：2um-10um5.內(nèi)徑：10mm以下（分析），10mm以上（制備）6.長(zhǎng)度：100、150、250、300mm,色譜柱選擇,.,色譜柱填料選擇,粒度均勻（3，3.5,5um),粒徑小，柱壓高，理論塔板數(shù)高，容易堵柱。低酸度表面(硅醇基團(tuán)被屏蔽），可以減少拖尾寬的pH范圍，可以有較大的調(diào)節(jié)自由度,.,色譜柱選擇,長(zhǎng)度：75mm,150mm,250mm,壓力和理論塔板正比與柱長(zhǎng)內(nèi)徑：2mm,4.6mm,10mm粒徑：3um,3.5um,5um孔徑：100A,300A,.,流動(dòng)相選擇,溶劑截止波長(zhǎng)(nm)水190乙腈190甲醇210乙醇210異丙醇210正己烷210四氫呋喃210二氯甲烷240氯仿240,.,甲醇和乙腈的紫外吸收?qǐng)D,線性范圍和檢出限度都有影響,.,不同混合溶劑的粘度比較,.,分離度（R1.5）和峰型（1.05T0.95）,.,可接受的分離條件K,可以接受的分離應(yīng)該是1k20,or2k10better。K=(tr-t0)/t0T0指死時(shí)間，一般相當(dāng)于溶劑峰出峰時(shí)間K與流速變化關(guān)系不大，K小受干擾大，k大則分析時(shí)間太長(zhǎng)。,.,理論塔板數(shù),.,分離度,w1,w2是峰1峰2的基線寬度W0.5,1,w0.5,2是峰1和峰2的半高峰寬,.,分離度與k（容量因子）的關(guān)系,所以分離的第一步就是控制1k20,或者最好是2k10方法：有機(jī)相100%,90%,80%,70每減少10%,k值變化為2.53倍,.,分離度80%-70%-60%,.,分離度（48%-47%-46%),.,更換有機(jī)相,a:甲醇-水b:THF-水c:甲醇：THF:水,.,總結(jié),1調(diào)節(jié)有機(jī)溶劑比例(10%)使k值可以接受2微調(diào)有機(jī)溶劑比例(1%)，使分離完全3更換有機(jī)溶劑MeOH,THF,CAN4混合使用有機(jī)溶劑記錄每一次條件變化對(duì)譜峰的影響,.,其他控制選擇性的因素,流動(dòng)相pH值柱溫不同品牌色譜柱離子對(duì)試劑,.,流動(dòng)相pH值,1,2酸性化合物4,5堿性化合物3中性化合物圖中曲線的拐點(diǎn)為該化合物的pKapH57之間會(huì)有較好的分離，5附近比較穩(wěn)定,.,流動(dòng)相pH值,.,流動(dòng)相pH值,.,pH值的影響(pka),一組苯甲酸(pka=4.2)同系物的分離情況A:pH2.5B:pH3.0C:pH3.5D:pH4.0,.,pH值的影響,pH值必須在該緩沖鹽的pKa1以內(nèi)才有較好作用，超過(guò)此范圍，會(huì)使得色譜條件不穩(wěn)定，重復(fù)性較差由此得出磷酸鹽緩沖液可用于pH2.0-3.1,6.2.-8.2醋酸鹽緩沖液可用于pH3.8-5.8,.,方式不同柱效不同,色譜條件色譜柱：KromasilC184.6250mm5um，柱溫：室溫，波長(zhǎng)：203nm流速：1.0ml/min2.梯度：乙腈：水為流動(dòng)相1.流動(dòng)相：乙腈：水（22：78）為流動(dòng)相0min20:80柱效:1150020min40:60人參皂苷Rg1(樣品)柱效:60000,.,柱溫的影響,溫度變化1度，Rt變化13%A:30B:35C:40D:45溫度控制對(duì)定量分析很重要,.,更換色譜柱的影響,AC8柱B苯基柱C氰基柱,.,更換色譜柱的影響,AC8柱B苯基柱C氰基柱由于更換色譜柱會(huì)影響峰的次序，所以這是最后的選擇,.,流速的影響,A3umdpB5umdpC10umdp從左到右1,2,4ml/min改變流速對(duì)分離影響不大，但可以縮短分析時(shí)間,.,填料及外型影響,Dp：2.5um,3.5um,5um,10um（柱壓，理論塔板數(shù)）長(zhǎng)度：20,30,50,100,150,250mm（柱壓，理論塔板數(shù)）內(nèi)徑：2.1,3.0,3.9,4.6mm（線速度）,.,a150mmP=1800psib250mmP=3000psi,柱長(zhǎng)與柱壓和RT成比例,.,改變粒度，長(zhǎng)度，流速,150-mml,3-m，1-mL/min,1250psi100-mm,3-m，1-mL/min,825psi100-mm,3-m2-mL/min,1650psi,.,緩沖鹽（離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)）的影響,色譜柱：DionexacclaimC18，5um，250*4.6mm流動(dòng)相：CH3CN:(NH4OAc溶液,pH5.2）20:80檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm流速：1.0ml/min1050mM濃度,.,檢測(cè)器的影響,.,檢測(cè)波長(zhǎng)的影響,.,二.色譜條件的開(kāi)發(fā),.,色譜條件開(kāi)發(fā)的目標(biāo),二高一低：專屬性高、準(zhǔn)確度高、成本低是一個(gè)色譜工作者追求的目標(biāo)。在盡量短的保留時(shí)間內(nèi)得到最佳的峰型、合適的分離度。,.,等度洗脫的特點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)操作簡(jiǎn)單、方便重現(xiàn)性好缺點(diǎn)不適合某些復(fù)雜物質(zhì),.,梯度洗脫的特點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)分離能力增加檢測(cè)靈敏度提高缺點(diǎn)儀器設(shè)備要求高不適合某些檢測(cè)方式,.,等度和梯度獲得柱效不同,色譜柱：DionexacclaimC18，250*4.6mm，柱溫：25，波長(zhǎng)：203nm流速：1.0ml/min樣品：人參皂苷Rg11.等度：乙腈：水（22：78）為流動(dòng)相2.梯度：乙腈：水為流動(dòng)相0min20:8020min40:60,.,等度和梯度獲得柱效不同,柱效2.1萬(wàn),柱效6萬(wàn),.,艱難的選擇,分離度分析時(shí)間系統(tǒng)壓力在三者之間作出最符合實(shí)際情況的選擇,.,快速尋找方法的起點(diǎn),傳統(tǒng)的建立方法模式需要較長(zhǎng)的時(shí)間，100%，90%,現(xiàn)代儀器多為三元或兩元泵系統(tǒng)，可以方便的在整個(gè)流程中自由的變化比例，因此可以通過(guò)探索性梯度運(yùn)行來(lái)尋找最佳方法入口。,.,確定梯度運(yùn)行的方法,設(shè)計(jì)一個(gè)30分鐘的運(yùn)行，推薦條件：250*4.6mm5um1.0ml/min甲醇0min5%30100%35100%,.,一個(gè)實(shí)例,tg第一個(gè)譜峰和最后一個(gè)譜峰的時(shí)間差Tg整個(gè)梯度運(yùn)行時(shí)間tg/tg0.4梯度tg/tg=（28.6-18.3)/30=0.34，因此可以分別嘗試,.,由梯度變換為等度,平均保留時(shí)間t=(18.3+28.6)/2=23.5陡度=(100-5)/30=3.17等度比例=5+3.17*23.5=79%,.,等度（79%)運(yùn)行結(jié)果（考慮K?）,.,由梯度變換梯度(K?),第一個(gè)譜峰18.3對(duì)應(yīng)5+3.17*18.3=63%(18.3-2.5)/2.5=6.32,6.32/3=2.1(K=1)最后一個(gè)譜峰28.6對(duì)應(yīng)5+3.17*28.6=95%梯度時(shí)間為100-5=95-4230XX=16min,陡度不變,.,第二次梯度運(yùn)行結(jié)果,TimeB%04216952095,.,液相色譜的方法開(kāi)發(fā),（二）梯度方法,.,梯度的洗脫方式,高壓梯度及低壓梯度,.,梯度一般方法,.,梯度洗脫的可變參數(shù),梯度的陡度梯度的變化形狀,.,如不用梯度：分離不理想,.,梯度條件的優(yōu)化,.,梯度曲線的變化凹線,.,梯度曲線的變化凸線,.,梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例-第一步,開(kāi)發(fā)一個(gè)有9個(gè)烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的條件下(0-100%水-乙腈)，分離不理想。整個(gè)色譜峰組保留時(shí)間太長(zhǎng)，分離度也不好。,.,梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例-第二步,為使色譜峰前移，提高起始時(shí)乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分離得到改善。但是9個(gè)化合物出了10個(gè)色譜峰，說(shuō)明有雜質(zhì)存在，很可能是流動(dòng)相水中的。,.,梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例-第三步,從空白梯度圖顯示，在同樣的色譜條件，同樣的檢測(cè)靈敏度下，共有兩個(gè)雜質(zhì)峰。說(shuō)明流動(dòng)相水中的雜質(zhì)在此條件下可能會(huì)對(duì)檢測(cè)有影響。,.,梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例-第四步,空白梯度圖同樣品的色譜圖進(jìn)行對(duì)照后，我們看到雜質(zhì)（共兩個(gè)峰）中的第一個(gè)小峰對(duì)第8個(gè)色譜峰有干擾，會(huì)使其定量分析結(jié)果不準(zhǔn)確。,.,梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例-第五步,根據(jù)“梯度曲線下的面積越大，洗脫能力越強(qiáng)”的規(guī)律，試用#5曲線使3-9號(hào)峰提前(曲線5，50-100%B)，但是小峰仍沒(méi)有分出來(lái)。,.,梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例-第六步,根據(jù)“梯度曲線下的面積越大，洗脫能力越強(qiáng)”的規(guī)律，試用#5曲線使3-9號(hào)峰提前，改用50-95%B見(jiàn)到好的現(xiàn)象。,.,梯度方法開(kāi)發(fā)實(shí)例-第七步,最后用50-90%B，曲線4，得到好的結(jié)果。,.,.,色譜應(yīng)用實(shí)例欣弗事件,色譜柱：EclipseXDB-C84.6250mm5um（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)）流動(dòng)相：(取磷酸二氫鉀10.54g，溶于775ml水中，用磷酸調(diào)pH值至2.5)-乙腈檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm柱溫：25流速：1.0ml/min,克林霉素磷酸酯,775225,8218,.,色譜應(yīng)用實(shí)例欣弗事件,色譜柱：EclipseXDB-C84.6250mm5um流動(dòng)相：(取磷酸二氫鉀10.54g，溶于775ml水中，用40%氫氧化鉀調(diào)pH值至5.6)-乙腈(775225)為流動(dòng)相檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm柱溫：25流速：1.0ml/min分離度大于6,克林霉素磷酸酯,克林霉素,.,色譜應(yīng)用實(shí)例【三聚氰胺(牛奶事件),色譜柱：VenusilASB-C184.6*250,5um;（FDA標(biāo)準(zhǔn)）流動(dòng)相：(10mM檸檬酸，10mM辛烷磺酸鈉，調(diào)pH為3.0)：乙腈=85：15檢測(cè)波長(zhǎng)：240nm柱溫：40流速：1.0ml/min分子式：C3N6H6、C3N3(NH2)3分子量：126.12含氮量：66.6%,.,色譜應(yīng)用實(shí)例（紫杉醇注射液）,色譜柱：DionexacclaimC18，250*4.6mm（黃金植物）流動(dòng)相：乙腈-水（40：60），洗脫至主峰出完（約27分鐘），然后以每分鐘1.6%的速度增加乙腈的比例，25分鐘后，乙腈比例增至80%，再以每分鐘4%的速度降低乙腈的比例，10分鐘后，乙腈比例降至40%，保持此比例10分鐘。檢測(cè)波長(zhǎng)：227nm流速：1.0ml/min,紫杉醇,.,色譜應(yīng)用實(shí)例（紫杉醇注射液）,色譜柱：DionexacclaimC18，250*4.6mm流動(dòng)相：甲醇-水-乙腈（30：40：30）檢測(cè)波長(zhǎng)：227nm流速：1.0ml/min,炔諾酮,紫杉醇,.,色譜應(yīng)用實(shí)例（血塞通崩解片）,色譜柱：DionexacclaimC18，250*4.6mm，波長(zhǎng)：203nm時(shí)間（min）乙腈水020%80%2040%60%2120%80%2620%80%,三七皂苷R1,人參皂苷Rg1,人參皂苷Rb1,.,色譜應(yīng)用實(shí)例（膽酸鈉原料）,色譜柱：DionexacclaimC18，250*4.6mm，波長(zhǎng)：205nm時(shí)間（min）乙腈0.2%磷酸二氫鉀溶液(磷酸調(diào)PH值至2.5)025%75%3040%60%4040%60%5025%75%,指紋圖譜,.,色譜應(yīng)用實(shí)例（抗生素）,色譜柱：DionexacclaimC18，250*4.6mm，波長(zhǎng)：254nm流動(dòng)相：乙腈：（三乙胺14ml，加水100ml,醋酸調(diào)PH值至2.5)=18：82流速：1.0ml/min樣品：注射用頭孢哌酮鈉,對(duì)照品,樣品,1.頭孢哌酮降解物B2.頭孢哌酮3.頭孢哌酮S異構(gòu)體,.,色譜應(yīng)用實(shí)例（酒石酸長(zhǎng)春瑞濱原料）,色譜柱：UtimateTMXB-C184.6250mm5um，波長(zhǎng)：267nm流動(dòng)相：0.05mol/L磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.2)-0.2%癸烷磺酸鈉的甲醇溶液（3367）柱溫：40流速：1.0ml/min（雜質(zhì)A+光照）,.,色譜應(yīng)用實(shí)例（酒石酸長(zhǎng)春瑞濱原料）,色譜柱：UtimateTMXB-C184.6250mm5um，波長(zhǎng)：267nm流動(dòng)相：0.05mol/L磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.2)-0.2%癸烷磺酸鈉的甲醇溶液（3367）柱溫：40流速：1.0ml/min（樣品）,.,色譜應(yīng)用實(shí)例（酒石酸長(zhǎng)春瑞濱原料）,色譜柱：UtimateTMXB-C184.6250mm5um，波長(zhǎng)：267nm流動(dòng)相：0.05mol/L磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.2)-0.2%癸烷磺酸鈉的甲醇溶液（3367）柱溫：40流速：1.0ml/min（中間體+樣品）,.,色譜應(yīng)用實(shí)例（酒石酸長(zhǎng)春瑞濱原料）,色譜柱：UtimateTMXB-C184.6250mm5um，波長(zhǎng)：267nm流動(dòng)相：0.05mol/L磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.2)-0.2%癸烷磺酸鈉的甲醇溶液（3367）柱溫：40流速：1.0ml/min（樣品光照）,.,色譜應(yīng)用實(shí)例（多糖）,色譜柱：凝膠柱（水相），流動(dòng)相：水檢測(cè)器：RID柱溫：25流速：1.0ml/min,1,2,3,4,Mn1：19340002：1085003：69304：550,.,有機(jī)碳,0,5,10,15,C14,C6,C7,C8,C10,C11,C12,C5,C13,C9,柱子:5m,DimensionsC18,4.6x150mm,流動(dòng)相:ACH3CN,B-H2O流速：1.0mL/min0min30%70%柱溫：30C15min80%20%檢測(cè)器：ELSDetector20min80%20%,.,色譜應(yīng)用實(shí)例（維生素）,色譜柱：硅膠鍵合NH2柱，150*4.6m