生命科學(xué)進(jìn)展ppt課件

生命科學(xué)進(jìn)展,羅曉霞,1,中心法則,生命現(xiàn)象的研究逐漸由獲取基因序列信息轉(zhuǎn)向研究基因功能，基因功能的具體體現(xiàn)者就是蛋白質(zhì)。,前言：,2,蛋白質(zhì)相互作用,蛋白質(zhì)可以通過某種方式與蛋白質(zhì)，核酸或其他分子之間發(fā)生相互作用而形成一定形態(tài)的蛋白復(fù)合物。,多亞基蛋白復(fù)合體,酶-底物,抗原-抗體,3,研究蛋白質(zhì)相互作用的重要意義,絕大多數(shù)疾病都是由特定蛋白質(zhì)相互作用所致。對(duì)200種蛋白質(zhì)及2000種組合結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析后，發(fā)現(xiàn)其中三分之一的蛋白質(zhì)相互組合會(huì)導(dǎo)致疾??；容易導(dǎo)致疾病的蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)結(jié)合以后也將變得十分活躍，致使發(fā)病和病情惡化。,蛋白質(zhì)相互作用和識(shí)別在諸如DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分泌，生物催化、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、新陳代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫、細(xì)胞調(diào)控等多種重要的生命過程起著重要的作用。,蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白復(fù)合物是細(xì)胞各種基本功能的主要完成者。,4,每一種蛋白質(zhì)不是孤立存在于細(xì)胞中，而是與其它蛋白質(zhì)或核酸或其他小分子一起進(jìn)行相互作用來行使其功能，從而使得細(xì)胞中所有蛋白質(zhì)形成一個(gè)相互作用的網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)功能相同和相似的蛋白質(zhì)在一起組成相關(guān)的功能模塊，以完成相關(guān)的生理功能。,蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),5,蛋白質(zhì)相互作用的檢測(cè)和分析方法,一，酵母雙雜交系統(tǒng)，YeastTwo-HybridSystem；,二，噬菌體表面展示技術(shù)，PhageDisplay；,1.谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶沉淀，GST-pulldown；,三，基于親和層析的蛋白質(zhì)相互作用研究平臺(tái),2.免疫共沉淀，Co-immunoprecipitation；,3.親和印跡，Ligandblot。,6,一，酵母雙雜交系統(tǒng)YeastTwo-HybridSystem,1989年Field和Song等人在酵母細(xì)胞中設(shè)計(jì)的分析蛋白質(zhì)相互作用的方法，以真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)構(gòu)和活性特點(diǎn)為基礎(chǔ)的。,Stelzl等(2005)和Raul等(2005)則先后分析了人腦組織、人已知ORF中大規(guī)模的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。,Rain等(2001)用該法繪制了人類胃腸道病原菌Helicobacterpylori的大規(guī)模蛋白質(zhì)相互作用圖譜。,隨后，Giot等(2003)和Li等(2004)在果蠅和線蟲中也成功地研究了大規(guī)模的蛋白質(zhì)相互作用。,7,酵母激活因子GAL4：N端：147個(gè)氨基酸組成的DNA結(jié)合域(DNAbindingdomain,BD)，C端：113個(gè)氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活域(transcriptionactivationdomain,AD)。GAL4分子的DNA結(jié)合域可以和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結(jié)合，而轉(zhuǎn)錄激活域則能激活UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。組成部分：（1）與BD融合的蛋白表達(dá)載體，被表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白（bait）；（2）與AD融合的蛋白表達(dá)載體，被其表達(dá)的蛋白稱靶蛋白（prey）；（3）帶由一個(gè)或多個(gè)報(bào)告基因的宿主菌株。,酵母雙雜交系統(tǒng)工作原理,8,酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)流程,9,酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用范圍,檢測(cè)已知蛋白質(zhì)之間的相互作用；確定蛋白質(zhì)相互作用功能區(qū)域位點(diǎn)；篩選與靶蛋白發(fā)生相互作用的未知蛋白。,10,不需分離和標(biāo)記靶蛋白，采用高拷貝和強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體使雜合蛋白過量表達(dá)，避免蛋白質(zhì)純化過程；檢測(cè)在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，真實(shí)反應(yīng)體內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用情況；敏感度高，可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用；可進(jìn)行高通量篩選；成本低，無需特殊的檢測(cè)設(shè)備?；蛐秃捅硇拖嗦?lián)系，可直接得到相互作用蛋白的編碼序列。,酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn),11,限于檢測(cè)定位于細(xì)胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)間相互作用；假陽性：本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能的蛋白；cDNA反向插入；融合蛋白可能會(huì)影響蛋白的真實(shí)結(jié)構(gòu)和功能。蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì),酵母雙雜交系統(tǒng)的局限性,12,二，噬菌體表面展示技術(shù)PhageDisplay,噬菌體：感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒。,13,1985年Smith證實(shí)噬菌體fd基因組能通過基因工程的手段進(jìn)行改造。1988年P(guān)armley將已知抗原決定簇與噬菌體PN端融合呈現(xiàn)在其表面。1990年McCafferty用噬菌體展示技術(shù)篩選溶菌酶的單鏈抗體成功使噬菌體展示技術(shù)進(jìn)入一個(gè)廣泛應(yīng)用的時(shí)代。一系列噬菌體文庫(kù)的構(gòu)建噬菌體展示技術(shù)煥發(fā)出了新的生命力。,噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展簡(jiǎn)史,14,利用固相支持物上的抗體或受體，采用親和篩選法從噬菌體文庫(kù)中篩選出能結(jié)合篩選分子的目的噬菌體。,在噬菌體pIII和p衣殼蛋白N端插入外源待篩基因編碼的蛋白或cDNA文庫(kù)，形成的融合蛋白表達(dá)在噬菌體顆粒的表面；,外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)在噬菌體的表面，其編碼基因可通過分泌型噬菌體的單鏈DNA測(cè)序推導(dǎo)出來。,噬菌體表面展示技術(shù)原理,15,噬菌體表面展示操作流程,構(gòu)建cDNA文庫(kù)，使外源基因與外殼蛋白基因融合，導(dǎo)入噬菌體,Display,Bindtoantigen,Washtoremoveunboundphage,Elute,Amplify,Analyze,Detect,Elisa,噬菌體展示技術(shù)一般要經(jīng)過多輪的篩選，這樣就可以得到在文庫(kù)中含量很低的與配基特異作用的蛋白質(zhì)。,16,大規(guī)模篩選與特異抗體或受體相互作用的未知蛋白質(zhì)；研究抗體或受體與抗原或底物的結(jié)合位點(diǎn)；可用于構(gòu)建隨機(jī)多肽庫(kù)、抗體庫(kù)和蛋白文庫(kù)；研究新型多肽藥物、疫苗和抗體；可研究蛋白質(zhì)與核酸相互作用的生物學(xué)過程；非蛋白小分子與蛋白相互作用的研究；酶作用底物的分析。,噬菌體表面展示應(yīng)用范圍,17,應(yīng)用范圍非常廣；可用于高通量篩選；可研究含量很低的與配體特異作用的蛋白質(zhì)；可直接得到相互作用蛋白的編碼序列。,噬菌體表面展示優(yōu)點(diǎn),需要標(biāo)記的抗體或配體來檢測(cè)結(jié)合情況；外源蛋白大小受到限制，不能研究大分子量蛋白質(zhì)的相互作用；原核表達(dá)體系中外源蛋白質(zhì)無法正確折疊或修飾；融合蛋白可能會(huì)影響到蛋白質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)或生物活性。,噬菌體表面展示缺點(diǎn),18,1.谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶沉淀試驗(yàn)(GST-pulldown),三、基于親和層析的蛋白質(zhì)相互作用研究平臺(tái),2.免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation),3.Ligandblot,基本原理是將一種蛋白質(zhì)或抗體固定于某種基質(zhì)上（如Sepharose，NC膜或PVDF膜等），當(dāng)細(xì)胞抽提液經(jīng)過改基質(zhì)時(shí)，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒有吸附的非目標(biāo)蛋白則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過改變洗脫液或者洗脫條件而回收下來，然后對(duì)其進(jìn)行分析鑒定。,19,1.谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶沉淀試驗(yàn)(GST-pulldown),1988年smith等利用谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶融合標(biāo)簽從細(xì)菌中一步純化出GST融合蛋白，從此GST融合蛋白在蛋白質(zhì)相互作用研究領(lǐng)域里得到了極大的推廣。,GST-pulldown方法是將誘餌蛋白質(zhì)和GST標(biāo)簽融合表達(dá)。一步純化后與含有目的蛋白質(zhì)的溶液培育，之后利用谷胱甘肽瓊脂糖球珠將融合蛋白:目的蛋白復(fù)合物沉淀下來，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳或質(zhì)譜鑒定與誘餌蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)。,20,GST,X,谷胱甘肽-瓊脂糖球珠,細(xì)胞裂解物,4下孵育2h,GST融合蛋白,GST,X,GST,X,GST,X,Y,GST-pulldown篩選未知的結(jié)合蛋白,設(shè)置GST對(duì)照，排除GST的影響,Y,Y,Y,Y,Bind,Washtoremoveunboundprotein,Elute,Analyze,Bind,21,GST-pulldown驗(yàn)證兩個(gè)已知蛋白的相互作用,GST,X,谷胱甘肽-瓊脂糖球珠,純化的Y蛋白,4下孵育2h,GST融合蛋白,GST,X,GST,X,GST,+,+,GST,純化的Y蛋白,GST,Y,Y,Y,Bind,Washtoremoveunboundprotein,Detect,Bind,Bind,22,不需要制備抗體來檢測(cè)結(jié)合情況；不需要對(duì)誘餌蛋白進(jìn)行標(biāo)記，避免了使用同位素等危險(xiǎn)物質(zhì)；,GST-pulldown的優(yōu)點(diǎn),GST-pulldown的缺點(diǎn),2.假陽性。蛋白質(zhì)所帶電荷引起的，并不是生理性的相互作用；有時(shí)會(huì)檢測(cè)到兩種在細(xì)胞中不可能相遇卻有極強(qiáng)親和力的蛋白。,該方法只適用于確定體外的相互作用；,3.融合蛋白可能會(huì)影響蛋白的真實(shí)結(jié)構(gòu)和功能。,23,原理：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。之后純化靶蛋白免疫復(fù)合物，凝膠電泳分離后，質(zhì)譜鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白。,2.免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation),24,Binding,wash,elution,細(xì)胞裂解物,Detection,免疫共沉淀技術(shù)流程,25,檢測(cè)是在生理?xiàng)l件下進(jìn)行，可以真實(shí)地體現(xiàn)在生命過程中蛋白質(zhì)之間的相互作用；可進(jìn)行大規(guī)模的篩選；可檢測(cè)依賴于修飾的蛋白質(zhì)之間的相互作用;可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。,免疫共沉淀技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),免疫共沉淀技術(shù)的缺點(diǎn),靈敏性不高。不能檢測(cè)和分析低表達(dá)量的蛋白之間的相互作用；假陽性。受免疫球蛋白的干擾容易產(chǎn)生假陽性；需要制備高質(zhì)量抗體。以終產(chǎn)物為檢測(cè)對(duì)象，檢測(cè)不到瞬間有相互作用的蛋白質(zhì)；,26,3.親和印記，Ligandblot,將PAGE膠上分離好的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，然后檢測(cè)哪種蛋白能與標(biāo)記的誘餌蛋白發(fā)生作用，最后通過顯影或顯色反應(yīng)信號(hào)確定相互作用蛋白，最后通過質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行鑒定。,27,誘餌蛋白的標(biāo)記技術(shù),PNAS,2007,JBC,2005,FEBSJ,2008,樣品蛋白的分離和固定技術(shù),Ligandblot的應(yīng)用,BBRC,2007,28,1.轉(zhuǎn)膜前需要將蛋白質(zhì)復(fù)性，不能完全恢復(fù)到天然狀態(tài)；,Ligandblot技術(shù)的缺點(diǎn),2.需要對(duì)蛋白進(jìn)行標(biāo)記或要制備抗體；,2.靈敏度不高，很難鑒定分離低表達(dá)量的相互作用蛋白；,2.實(shí)驗(yàn)在體外進(jìn)行，很難鑒定修飾的蛋白或蛋白復(fù)合體。,Ligandblot技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),1.操作簡(jiǎn)便，尤其是對(duì)于在變性條件下也能發(fā)生相互作用的蛋白的鑒定和驗(yàn)證；,2.可鑒定靶蛋白與受體的結(jié)合位點(diǎn)。,29,Outline,RegulatoryRNAsinBacteriaDiscoveryofsRNATargetofsRNAPredictionsRNAinBacilluscereusgroup,30,RegulatoryRNAsinBacteria,RiboswitchesCRISPRsRNAs(smallRNAs),31,Riboswitches,位于所調(diào)節(jié)的mRNA的5端與所調(diào)節(jié)的mRNA一起轉(zhuǎn)錄通過改變RNA的結(jié)構(gòu)來影響轉(zhuǎn)錄或翻譯由兩部分組成：aptamerregion，結(jié)合配體；expressionplatform，改變RNA結(jié)構(gòu)能感應(yīng)氨基酸，核苷酸，金屬離子等小分子，也能感應(yīng)細(xì)胞組分（如特殊的tRNA），還能感應(yīng)溫度等環(huán)境因素,32,Riboswitches的響應(yīng)配體的作用方式,通過改變mRNA的結(jié)構(gòu)影響轉(zhuǎn)錄或翻譯,WatersandStorz,Cell,2009,33,Riboswitches響應(yīng)溫度的作用方式,低溫時(shí)，SD序列與ASD序列配對(duì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)溫度升高時(shí)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)解開，露出SD序列,Henkin,GenesDev.,2008,34,CRISPR結(jié)構(gòu)與功能,CASgene:CRISPR-associatedgene功能多數(shù)未知，但往往具有DNA或RNA結(jié)合domain，解螺旋酶Domain，內(nèi)切酶或者外切酶domainLeadersequence：大概550bp左右RepeatedDNA：24-47bp，重復(fù)2-249次Spacer：26-72bp,WatersandStorz,Cell,2009,35,CRISPR介導(dǎo)的phage抗性,Soreketal.,Nat.Rev.Microbiol.,2008,36,sRNA,sRNAsthatModulateProteinActivityCis-encodedbasepairingsRNATrans-encodedbasepairingsRNAExtendofsRNA,37,sRNAsthatModulateProteinActivity,大腸桿菌中作用的例子,WatersandStorz,Cell,2009,38,Cis-encodedbasepairingsRNA,具有獨(dú)立的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子，沒有ORF一般由目標(biāo)mRNA的互補(bǔ)鏈編碼，直接位于ORF的互補(bǔ)鏈或者operon的中間與目標(biāo)mRNA某區(qū)域完全配對(duì)目前大部分來源于噬菌體，質(zhì)粒，轉(zhuǎn)座子；在質(zhì)粒中，調(diào)節(jié)復(fù)制，分離等；在轉(zhuǎn)座子中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)座頻率；在噬菌體中，調(diào)節(jié)溶原與溶解,Brantl,FutureMicrobiol.,2009,39,ActionmenchanismofCis-encodedbasepairingsRNA,直接結(jié)合到RBS區(qū)或者mRNA中間，引起mRNA降解或者翻譯終止,WatersandStorz,Cell,2009,40,Trans-EncodedBasePairingsRNAs,往往位于基因之間的間隔區(qū)，有獨(dú)立的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)長(zhǎng)度一般50到600bp，主要是50到200nt之間與目標(biāo)基因相隔較遠(yuǎn)與目