第五章植物脫毒快繁技術(shù)

1、第五章、植物離體脫毒快繁技術(shù) 一、病毒危害 多數(shù)栽培植物，尤其多數(shù)栽培植物，尤其無(wú)性繁殖植物無(wú)性繁殖植物，都易受，都易受 到一種或幾種，甚至幾十種病毒的侵染。例如，到一種或幾種，甚至幾十種病毒的侵染。例如， 草莓染草莓染60多種病毒。并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，多種病毒。并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移， 侵染病毒的種類越來(lái)越多侵染病毒的種類越來(lái)越多。 植物病毒病原體可植物病毒病原體可通過(guò)維管束傳導(dǎo)通過(guò)維管束傳導(dǎo)。因此，。因此， 對(duì)無(wú)性繁殖的植物來(lái)說(shuō)，一旦感染上病毒之后，對(duì)無(wú)性繁殖的植物來(lái)說(shuō)，一旦感染上病毒之后， 就會(huì)代代相傳。就會(huì)代代相傳。 受病毒侵染的植物生長(zhǎng)緩慢、畸形、受病毒侵染的植物生長(zhǎng)緩慢、畸形、

2、產(chǎn)量產(chǎn)量大大 幅度下降，幅度下降，品質(zhì)品質(zhì)變劣，甚至完全喪失商品價(jià)值。變劣，甚至完全喪失商品價(jià)值。 目前，對(duì)細(xì)菌和真菌侵染的病害，可通過(guò)藥目前，對(duì)細(xì)菌和真菌侵染的病害，可通過(guò)藥 物處理達(dá)到治愈的目的。但還物處理達(dá)到治愈的目的。但還沒(méi)有治病毒的特效沒(méi)有治病毒的特效 藥藥。種子一般不帶病毒。種子一般不帶病毒(豆類植物除外豆類植物除外)，種子繁，種子繁 殖可得無(wú)毒植株。但對(duì)于無(wú)性繁殖植物，殖可得無(wú)毒植株。但對(duì)于無(wú)性繁殖植物，必須采必須采 取一些特殊方法脫除病毒取一些特殊方法脫除病毒。 脫毒快繁的一般過(guò)程 1、診斷：首先了解供試材料感染病毒的種類、診斷：首先了解供試材料感染病毒的種類 2、莖尖培養(yǎng)脫毒

3、或結(jié)合熱處理、莖尖培養(yǎng)脫毒或結(jié)合熱處理 3、鑒定、鑒定 4、繁殖、繁殖 5、馴化移植、馴化移植 1、熱處理脫毒原理： 病毒進(jìn)入植物細(xì)胞后，隨植物細(xì)胞病毒進(jìn)入植物細(xì)胞后，隨植物細(xì)胞DNA一起一起 復(fù)制。熱處理并不能殺死細(xì)胞，只是復(fù)制。熱處理并不能殺死細(xì)胞，只是鈍化病毒的鈍化病毒的 活性活性，使病毒在植物體內(nèi)增殖減緩或增殖停止，使病毒在植物體內(nèi)增殖減緩或增殖停止， 而失去病毒的侵染能力。而失去病毒的侵染能力。 熱處理是一種物理效應(yīng)，可加速植物細(xì)胞熱處理是一種物理效應(yīng)，可加速植物細(xì)胞 分裂，在激烈分裂的細(xì)胞中正常核蛋白合成占優(yōu)分裂，在激烈分裂的細(xì)胞中正常核蛋白合成占優(yōu) 勢(shì)，使植物細(xì)胞在與病毒繁殖的競(jìng)

4、爭(zhēng)中取勝。因勢(shì)，使植物細(xì)胞在與病毒繁殖的競(jìng)爭(zhēng)中取勝。因 此此加速分生組織細(xì)胞的分裂加速分生組織細(xì)胞的分裂，能夠獲得無(wú)病毒植，能夠獲得無(wú)病毒植 株。株。 二、脫毒方法 (一) 熱處理脫毒 依據(jù)依據(jù)病毒對(duì)高溫的敏感，寄主耐高溫病毒對(duì)高溫的敏感，寄主耐高溫。利。利 用這一差異，選擇適當(dāng)?shù)臏囟群吞幚頃r(shí)間，進(jìn)用這一差異，選擇適當(dāng)?shù)臏囟群吞幚頃r(shí)間，進(jìn) 行高溫處理，就能使寄主體內(nèi)病毒濃度降低，行高溫處理，就能使寄主體內(nèi)病毒濃度降低， 傳遞速度減慢或失去活性，而寄主細(xì)胞仍然存?zhèn)鬟f速度減慢或失去活性，而寄主細(xì)胞仍然存 活，并加快分裂和生長(zhǎng)?；睿⒓涌旆至押蜕L(zhǎng)。 (1)溫湯浸漬處理 (2)熱空氣處理 2、熱處理

5、脫毒方法 （1）溫水浸漬處理 適用于適用于休眠器官休眠器官，在，在50左右的溫水中浸漬左右的溫水中浸漬 10min至數(shù)小時(shí)，方法簡(jiǎn)便易行，但易使材料受至數(shù)小時(shí)，方法簡(jiǎn)便易行，但易使材料受 傷。傷。 （2）熱空氣處理 熱空氣處理對(duì)熱空氣處理對(duì)活躍生長(zhǎng)的莖尖活躍生長(zhǎng)的莖尖效果較好。將生效果較好。將生 長(zhǎng)的盆栽植株移入溫?zé)嶂委熛鋬?nèi)，長(zhǎng)的盆栽植株移入溫?zé)嶂委熛鋬?nèi)，一般一般35-40。 處理時(shí)間因植物而異，短則幾十分鐘，長(zhǎng)可達(dá)數(shù)處理時(shí)間因植物而異，短則幾十分鐘，長(zhǎng)可達(dá)數(shù) 月。月。 熱處理廣泛應(yīng)用于葡萄、草莓、馬鈴薯和菊熱處理廣泛應(yīng)用于葡萄、草莓、馬鈴薯和菊 花等植物。如：葡萄置于花等植物。如：葡萄置于3

6、8 可去除扇葉病毒。可去除扇葉病毒。 熱處理對(duì)熱處理對(duì)葡萄葡萄扇葉病毒、草莓斑駁病毒、蘋扇葉病毒、草莓斑駁病毒、蘋 果花葉病毒等球形病毒有作用，而對(duì)另一些病毒果花葉病毒等球形病毒有作用，而對(duì)另一些病毒 不起作用，因此，必須與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合脫毒效不起作用，因此，必須與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合脫毒效 果更好。果更好。 植物的去病毒技術(shù)植物的去病毒技術(shù)，實(shí)質(zhì)上就是采取不含，實(shí)質(zhì)上就是采取不含 病毒顆?；虿《绢w粒含量甚少的病毒顆?；虿《绢w粒含量甚少的0.10.5mm 帶帶12個(gè)葉原基的莖尖個(gè)葉原基的莖尖作為外植體，進(jìn)行微繁作為外植體，進(jìn)行微繁 殖，使其培養(yǎng)成完整的無(wú)病毒小植株的技術(shù)。殖，使其培養(yǎng)成完整的無(wú)病毒小

7、植株的技術(shù)。 （二）莖尖培養(yǎng)脫毒 1、莖尖培養(yǎng)脫毒原理 病毒在植物體內(nèi)分布不均勻病毒在植物體內(nèi)分布不均勻，其數(shù)量隨植株，其數(shù)量隨植株 部位及年齡而異，越靠近莖頂端區(qū)域，病毒感染部位及年齡而異，越靠近莖頂端區(qū)域，病毒感染 的程度越低，生長(zhǎng)點(diǎn)即分生組織（約的程度越低，生長(zhǎng)點(diǎn)即分生組織（約0.1-1mm） 幾乎不含或含病毒很少。幾乎不含或含病毒很少。 1、傳導(dǎo)抑制。植物體、傳導(dǎo)抑制。植物體病毒的移動(dòng)病毒的移動(dòng)主要靠主要靠2條途條途 徑：一是通過(guò)維管系統(tǒng)，而分生組織中尚未形成徑：一是通過(guò)維管系統(tǒng)，而分生組織中尚未形成 維管系統(tǒng)；二是通過(guò)胞間連絲，但這條途徑病毒維管系統(tǒng)；二是通過(guò)胞間連絲，但這條途徑病毒

8、 移動(dòng)速度非常慢，移動(dòng)速度非常慢，趕不上趕不上莖尖和根尖莖尖和根尖細(xì)胞不斷分細(xì)胞不斷分 裂和活躍的生長(zhǎng)速度。裂和活躍的生長(zhǎng)速度。 2、酶缺乏。莖尖中缺乏病毒合成所需的酶系，、酶缺乏。莖尖中缺乏病毒合成所需的酶系， 存在高水平內(nèi)源激素，可抑制病毒的增殖。存在高水平內(nèi)源激素，可抑制病毒的增殖。 莖尖分生組織不帶病毒莖尖分生組織不帶病毒，可能有，可能有4方面的方面的原因原因： v3、能量競(jìng)爭(zhēng)。當(dāng)植物細(xì)胞分裂、能量競(jìng)爭(zhēng)。當(dāng)植物細(xì)胞分裂DNA復(fù)制復(fù)制 時(shí)，病毒時(shí)，病毒DNA隨著復(fù)制。因此，植物細(xì)隨著復(fù)制。因此，植物細(xì) 胞分裂和病毒繁殖之間存在相互競(jìng)爭(zhēng)。胞分裂和病毒繁殖之間存在相互競(jìng)爭(zhēng)。 在旺盛分裂的分生

9、組織中，代謝活動(dòng)很在旺盛分裂的分生組織中，代謝活動(dòng)很 高，正常核蛋白合成占優(yōu)勢(shì)，使病毒無(wú)高，正常核蛋白合成占優(yōu)勢(shì)，使病毒無(wú) 法進(jìn)行復(fù)制。法進(jìn)行復(fù)制。 v4、抑制因子存在。在植物體內(nèi)存在有一、抑制因子存在。在植物體內(nèi)存在有一 種種“病毒鈍化系統(tǒng)病毒鈍化系統(tǒng)”（抑制因子假說(shuō)），（抑制因子假說(shuō)）， 在分生組織中的活性最高，因而使分生在分生組織中的活性最高，因而使分生 組織不受侵染。組織不受侵染。 2、培養(yǎng)基 一般以一般以White、MS為基本培養(yǎng)基，提高鉀鹽為基本培養(yǎng)基，提高鉀鹽 和銨鹽含量有利于莖尖生長(zhǎng)。和銨鹽含量有利于莖尖生長(zhǎng)。MS培養(yǎng)某些植物莖培養(yǎng)某些植物莖 尖時(shí)，有些離子濃度過(guò)高應(yīng)稀釋。尖時(shí)

10、，有些離子濃度過(guò)高應(yīng)稀釋。 在雙子葉植物中，激素可能在第在雙子葉植物中，激素可能在第2對(duì)葉原基中對(duì)葉原基中 合成，所以莖尖的圓錐組織生長(zhǎng)激素不能自給，合成，所以莖尖的圓錐組織生長(zhǎng)激素不能自給， 必須加入生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素，濃度要合適。在必須加入生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素，濃度要合適。在 生長(zhǎng)素中應(yīng)避免用易促進(jìn)愈傷組織化的生長(zhǎng)素中應(yīng)避免用易促進(jìn)愈傷組織化的2，4-D， 宜用宜用NAA或或IBA；細(xì)胞分裂素用細(xì)胞分裂素用KT或或BA；GA3對(duì)對(duì) 某些植物莖尖培養(yǎng)有用。某些植物莖尖培養(yǎng)有用。 材料選擇、消毒材料選擇、消毒 微莖尖的剝?nèi)∥⑶o尖的剝?nèi)?接種接種 3、莖尖的培養(yǎng)方法 3、莖尖的培養(yǎng)方法 需要一臺(tái)需

11、要一臺(tái)解剖鏡解剖鏡（8-40倍）。倍）。 剝離莖尖要?jiǎng)冸x莖尖要迅速迅速并盡快接種，或在一個(gè)襯有并盡快接種，或在一個(gè)襯有 無(wú)菌濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行操作，無(wú)菌濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行操作，以防莖尖變干以防莖尖變干。 莖尖分生組織由于有彼此重疊的葉原基的嚴(yán)莖尖分生組織由于有彼此重疊的葉原基的嚴(yán) 密保護(hù)，只要仔細(xì)解剖，密保護(hù)，只要仔細(xì)解剖，(無(wú)須表面消毒無(wú)須表面消毒)就可得就可得 到無(wú)菌的外植體。有時(shí)消毒處理會(huì)增加培養(yǎng)物的到無(wú)菌的外植體。有時(shí)消毒處理會(huì)增加培養(yǎng)物的 污染率。污染率。 即：葉片包被嚴(yán)緊的芽，如菊花、蘭花，只即：葉片包被嚴(yán)緊的芽，如菊花、蘭花，只 須須75%酒精中浸蘸一下，而葉片包被松散的芽，

12、酒精中浸蘸一下，而葉片包被松散的芽， 如香石竹、馬鈴薯等，則要用如香石竹、馬鈴薯等，則要用0.1%次氯酸鈉表次氯酸鈉表 面消毒面消毒10min。 莖尖長(zhǎng)莖尖長(zhǎng) （）（） 葉原基數(shù)葉原基數(shù) 小植株數(shù)小植株數(shù) 脫毒植株脫毒植株 數(shù)數(shù) 脫毒率脫毒率 （）（） 0.121502448 0.272421842.9 0.646400 離體莖尖大小對(duì)馬鈴薯脫毒效果的影響離體莖尖大小對(duì)馬鈴薯脫毒效果的影響 切取莖尖越小脫毒效果越好，但太小不易切取莖尖越小脫毒效果越好，但太小不易 成活，過(guò)大又不能保證完全除去病毒，所以成活，過(guò)大又不能保證完全除去病毒，所以莖莖 尖大小要合適。尖大小要合適。 剝?nèi)∏o尖過(guò)程剝?nèi)∏o尖

13、過(guò)程: 解剖鏡解剖鏡下用解剖針將葉片剝掉，下用解剖針將葉片剝掉，解剖針要常消毒解剖針要常消毒。當(dāng)。當(dāng) 一個(gè)半圓球的頂端分生組織充分暴露出來(lái)之后，用解剖刀一個(gè)半圓球的頂端分生組織充分暴露出來(lái)之后，用解剖刀 片將帶片將帶1-2個(gè)葉原基個(gè)葉原基的分生組織切下，接到培養(yǎng)基上。的分生組織切下，接到培養(yǎng)基上。 將接種的莖尖置于將接種的莖尖置于22左右溫度下。左右溫度下。 2000-3000lx 16h/d 光照下培養(yǎng)。由于在低溫和短日照下，莖尖有可能光照下培養(yǎng)。由于在低溫和短日照下，莖尖有可能 進(jìn)入休眠；所以進(jìn)入休眠；所以較高的溫度和充足的日照時(shí)間必須保證較高的溫度和充足的日照時(shí)間必須保證。 微莖尖需數(shù)月

14、才能成功。微莖尖需數(shù)月才能成功。 莖尖培養(yǎng)的繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)和一般器莖尖培養(yǎng)的繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)和一般器 官的培養(yǎng)相同。官的培養(yǎng)相同。 莖尖培養(yǎng)脫毒，由于其脫毒效果好，后代莖尖培養(yǎng)脫毒，由于其脫毒效果好，后代 穩(wěn)定，所以是目前培育無(wú)病毒苗最廣泛和最穩(wěn)定，所以是目前培育無(wú)病毒苗最廣泛和最 重要的一個(gè)途徑。重要的一個(gè)途徑。 4、影響微莖尖成活及脫毒的因素 （1）母體材料病毒侵染程度 被單一病毒感染的植株脫毒較容易，復(fù)合感染的較難。被單一病毒感染的植株脫毒較容易，復(fù)合感染的較難。 （2）外植體大小 在最適培養(yǎng)條件下，在最適培養(yǎng)條件下，外植體的大小外植體的大小決定莖尖的存決定莖尖的存 活率，外植體越

15、大，產(chǎn)生再生植株的機(jī)會(huì)也就越多。活率，外植體越大，產(chǎn)生再生植株的機(jī)會(huì)也就越多。 除了外植體的大小之外，除了外植體的大小之外，葉原基的存在葉原基的存在與否也影響分與否也影響分 生組織形成植株的能力，一般認(rèn)為，葉原基能向分生生組織形成植株的能力，一般認(rèn)為，葉原基能向分生 組織提供生長(zhǎng)和分化所必需的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素。組織提供生長(zhǎng)和分化所必需的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素。 （2）培養(yǎng)條件 在莖尖培養(yǎng)中，在莖尖培養(yǎng)中，光下培養(yǎng)光下培養(yǎng)的效果通常比暗培養(yǎng)效果的效果通常比暗培養(yǎng)效果 好，如馬鈴薯莖尖培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)莖已長(zhǎng)到好，如馬鈴薯莖尖培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)莖已長(zhǎng)到1cm高時(shí)，光高時(shí)，光 照強(qiáng)度便增加到照強(qiáng)度便增加到4000lx

16、。 （3）外植體的生理狀態(tài) 莖尖最好要由莖尖最好要由活躍生長(zhǎng)活躍生長(zhǎng)的芽上切取。的芽上切取。 取芽的時(shí)間也很重要，一般選取芽的時(shí)間也很重要，一般選萌動(dòng)期萌動(dòng)期較好。否則較好。否則 采用適當(dāng)?shù)奶幚?，打破休眠才能進(jìn)行。采用適當(dāng)?shù)奶幚?，打破休眠才能進(jìn)行。 （三）莖尖與熱處理相結(jié)合方法 能克服單獨(dú)莖尖培養(yǎng)時(shí)，莖尖過(guò)小成活率太低，能克服單獨(dú)莖尖培養(yǎng)時(shí)，莖尖過(guò)小成活率太低， 莖尖太大又脫除不掉病毒的缺點(diǎn)。莖尖太大又脫除不掉病毒的缺點(diǎn)。 1、熱處理后取較大莖尖培養(yǎng)獲得脫毒苗。、熱處理后取較大莖尖培養(yǎng)獲得脫毒苗。 2、取莖尖（或莖段）培養(yǎng)獲得無(wú)菌苗。然后將試管、取莖尖（或莖段）培養(yǎng)獲得無(wú)菌苗。然后將試管 苗熱

17、處理，再取莖尖培養(yǎng)獲得脫毒苗。苗熱處理，再取莖尖培養(yǎng)獲得脫毒苗。 （四）其它途徑脫毒 1、愈傷組織培養(yǎng)脫毒 2、莖尖微體嫁接 3、化學(xué)療法脫毒 1、愈傷組織培養(yǎng)脫毒 愈傷組織細(xì)胞帶病原菌不均一，部分細(xì)胞不帶病愈傷組織細(xì)胞帶病原菌不均一，部分細(xì)胞不帶病 毒，由這些細(xì)胞再生的植株是無(wú)病毒的。多次繼代的毒，由這些細(xì)胞再生的植株是無(wú)病毒的。多次繼代的 愈傷組織中病毒含量下降，甚至檢測(cè)不出病毒。愈傷組織中病毒含量下降，甚至檢測(cè)不出病毒。 愈傷組織的某些細(xì)胞不帶病毒原因：愈傷組織的某些細(xì)胞不帶病毒原因： 1、病毒的復(fù)制速度趕不上細(xì)胞的增殖速度；、病毒的復(fù)制速度趕不上細(xì)胞的增殖速度； 2、有些細(xì)胞通過(guò)突變獲

18、得了抗病毒的抗性。、有些細(xì)胞通過(guò)突變獲得了抗病毒的抗性。 愈傷組織脫毒的缺陷是植株遺傳性不穩(wěn)定，可愈傷組織脫毒的缺陷是植株遺傳性不穩(wěn)定，可 能會(huì)產(chǎn)生變異植株。能會(huì)產(chǎn)生變異植株。 2、莖尖微體嫁接 木本植物莖尖培養(yǎng)難以生根成植株，將實(shí)生苗砧木本植物莖尖培養(yǎng)難以生根成植株，將實(shí)生苗砧 木在人工培養(yǎng)基上種植培育，再?gòu)某赡隉o(wú)病樹枝上切木在人工培養(yǎng)基上種植培育，再?gòu)某赡隉o(wú)病樹枝上切 取取0.4-1mm莖尖，在砧木上進(jìn)行試管微體嫁接，以獲莖尖，在砧木上進(jìn)行試管微體嫁接，以獲 得無(wú)病毒幼苗。得無(wú)病毒幼苗。 3、化學(xué)療法脫毒 病毒抑制劑 三、脫毒快繁材料的選擇 應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：應(yīng)注意以下幾點(diǎn)： 1）品種要可靠

19、）品種要可靠 2）要選擇經(jīng)當(dāng)?shù)卦耘啻_認(rèn)的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種來(lái)作）要選擇經(jīng)當(dāng)?shù)卦耘啻_認(rèn)的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種來(lái)作 為脫毒材料為脫毒材料 3）名貴的植物良種）名貴的植物良種 4）植物生長(zhǎng)旺盛期，再生率高，脫毒效果好）植物生長(zhǎng)旺盛期，再生率高，脫毒效果好 四、植物病毒的鑒定 1、外觀判斷法 2、指示植物法 3、抗血清鑒定法 4、電子顯微鏡檢查法 5、酶聯(lián)免疫鑒定法(ELISA) 1、外觀判斷法： 帶病毒株往往葉片發(fā)黃，凹凸不平，畸形，可根據(jù)這帶病毒株往往葉片發(fā)黃，凹凸不平，畸形，可根據(jù)這 些表現(xiàn)來(lái)判斷。但有些病毒表現(xiàn)不明顯，僅靠這一方法還些表現(xiàn)來(lái)判斷。但有些病毒表現(xiàn)不明顯，僅靠這一方法還 不夠。不夠。 2、指

20、示植物檢測(cè)法： 指示植物又稱鑒別寄主，指的是對(duì)某種或某些特指示植物又稱鑒別寄主，指的是對(duì)某種或某些特 定病毒非常敏感，而且癥狀表現(xiàn)十分明顯的植物。定病毒非常敏感，而且癥狀表現(xiàn)十分明顯的植物。 通常不同病毒應(yīng)選用不同的植物。馬鈴薯病毒常用指通常不同病毒應(yīng)選用不同的植物。馬鈴薯病毒常用指 示植物有千日紅、曼陀羅、豇豆、辣椒等。示植物有千日紅、曼陀羅、豇豆、辣椒等。 分為2種 汁液感染法（摩擦接種法） 嫁接檢測(cè)法 3、抗血清鑒定法（抗原抗體反應(yīng)） 原理：由于病毒是由蛋白質(zhì)和核酸組成的，是一種較原理：由于病毒是由蛋白質(zhì)和核酸組成的，是一種較 好的抗原。將病毒給動(dòng)物注射后產(chǎn)生抗體。抗原和抗體結(jié)好的抗原。

21、將病毒給動(dòng)物注射后產(chǎn)生抗體?？乖涂贵w結(jié) 合產(chǎn)生血清反應(yīng)?？乖翰《?。抗體：是指生物體在外來(lái)合產(chǎn)生血清反應(yīng)?？乖翰《??？贵w：是指生物體在外來(lái) 抗原的刺激下產(chǎn)生的一種免疫球蛋白，主要存在于血清中，抗原的刺激下產(chǎn)生的一種免疫球蛋白，主要存在于血清中， 含抗體的血清稱為抗血清。含抗體的血清稱為抗血清。 4、電子顯微鏡檢查法 直接觀察有無(wú)病毒存在，并根據(jù)病毒的大小、形狀和直接觀察有無(wú)病毒存在，并根據(jù)病毒的大小、形狀和 結(jié)構(gòu)等來(lái)判斷病毒種類。結(jié)構(gòu)等來(lái)判斷病毒種類。 5、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA) 把抗原把抗原-抗體的抗體的免疫反應(yīng)免疫反應(yīng)于于酶的催化反應(yīng)酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而發(fā)展相結(jié)合而發(fā)展 起來(lái)

22、的一種綜合性技術(shù)，靈敏度高，特異性強(qiáng)，發(fā)展最快起來(lái)的一種綜合性技術(shù)，靈敏度高，特異性強(qiáng)，發(fā)展最快 應(yīng)用最廣的方法。應(yīng)用最廣的方法。 原理：原理：采用酶標(biāo)記的特異抗體指示抗原采用酶標(biāo)記的特異抗體指示抗原-抗體的結(jié)合，抗體的結(jié)合， 從而檢測(cè)樣品中的抗原定量測(cè)定法。從而檢測(cè)樣品中的抗原定量測(cè)定法。 雙抗體夾心法雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，操作步驟是檢測(cè)抗原最常用的方法，操作步驟 如下：如下： (1)(1)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗 滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。 (2)(2)加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)

23、一段時(shí)間，加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間， 讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相 抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)?？乖瓘?fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。 (3)(3)加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗 體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體 上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。 (4)(4)加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為

24、有色產(chǎn) 物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。 五、快速繁殖 莖尖培養(yǎng)得到的脫毒苗不多，用于生產(chǎn)需擴(kuò)大繁殖。莖尖培養(yǎng)得到的脫毒苗不多，用于生產(chǎn)需擴(kuò)大繁殖。 擴(kuò)繁方法：擴(kuò)繁方法： 1）組培快繁）組培快繁 2）無(wú)毒苗栽到土壤中進(jìn)行擴(kuò)繁。如甘薯、草）無(wú)毒苗栽到土壤中進(jìn)行擴(kuò)繁。如甘薯、草 莓等利用蔓，馬鈴薯、姜、蒜等利用地下部分繁莓等利用蔓，馬鈴薯、姜、蒜等利用地下部分繁 殖。為了預(yù)防病毒再感染，擴(kuò)繁應(yīng)在培育溫室或殖。為了預(yù)防病毒再感染，擴(kuò)繁應(yīng)在培育溫室或 防蟲罩內(nèi)，因?yàn)槔ハx傳播病毒。防蟲罩內(nèi)，因?yàn)槔ハx傳播病毒。 3）兩種方法相結(jié)合，試管內(nèi)擴(kuò)繁，移

25、栽后再）兩種方法相結(jié)合，試管內(nèi)擴(kuò)繁，移栽后再 擴(kuò)繁。擴(kuò)繁。 注意：注意： 1、培養(yǎng)變異的產(chǎn)生，應(yīng)及時(shí)去除、培養(yǎng)變異的產(chǎn)生，應(yīng)及時(shí)去除 2、脫毒苗并非永遠(yuǎn)是無(wú)毒苗，由于昆蟲等的傳播，、脫毒苗并非永遠(yuǎn)是無(wú)毒苗，由于昆蟲等的傳播， 不免會(huì)再感染病毒，所以要經(jīng)常脫毒，一般脫毒苗不免會(huì)再感染病毒，所以要經(jīng)常脫毒，一般脫毒苗 用用13代代 。 脫毒試管苗為原原種繁殖一代為原種原脫毒試管苗為原原種繁殖一代為原種原 1代原代原2代代 楓樹快繁圖示楓樹快繁圖示 楓樹快繁圖示楓樹快繁圖示 月季快繁圖示月季快繁圖示 月季快繁圖示月季快繁圖示 月季快繁圖示月季快繁圖示 月季快繁圖示月季快繁圖示 v腋芽在生根培養(yǎng)基中生

26、長(zhǎng)兩周，即可有小的幼根生成，腋芽在生根培養(yǎng)基中生長(zhǎng)兩周，即可有小的幼根生成， 三周后，幼根可長(zhǎng)至三周后，幼根可長(zhǎng)至2 cm2 cm長(zhǎng)。長(zhǎng)。 v將上述月季苗經(jīng)過(guò)煉苗后，從培養(yǎng)基中取出，小心地將上述月季苗經(jīng)過(guò)煉苗后，從培養(yǎng)基中取出，小心地 洗去根上的培養(yǎng)基，然后將其接種在培養(yǎng)介質(zhì)中洗去根上的培養(yǎng)基，然后將其接種在培養(yǎng)介質(zhì)中( (營(yíng)養(yǎng)營(yíng)養(yǎng) 土土: :蛭石蛭石: :珍珠巖珍珠巖= 3:1:1)= 3:1:1)，再將培養(yǎng)介質(zhì)澆透水，用，再將培養(yǎng)介質(zhì)澆透水，用 保鮮膜封上，以防止水分的散失，然后將其放在弱光、保鮮膜封上，以防止水分的散失，然后將其放在弱光、 濕度大的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，待長(zhǎng)出新根后，可移入田間濕

27、度大的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，待長(zhǎng)出新根后，可移入田間 土壤中。具體過(guò)程如下圖：土壤中。具體過(guò)程如下圖： 月季快繁圖示月季快繁圖示 植物快繁的一般程序植物快繁的一般程序 v1.1.無(wú)菌母體植株的制備：無(wú)菌母體植株的制備： （取材、植物激素、（取材、植物激素、 防止褐化和有害物積累）防止褐化和有害物積累） v2.2.不定芽增殖不定芽增殖 ： （增殖的途徑：誘導(dǎo)形成大（增殖的途徑：誘導(dǎo)形成大 量胚狀體；誘導(dǎo)形成大量不定芽；促進(jìn)腋芽的量胚狀體；誘導(dǎo)形成大量不定芽；促進(jìn)腋芽的 快速形成；愈傷組織增殖）快速形成；愈傷組織增殖） v3. 3. 完整植株的形成：完整植株的形成： v4. 4. 再生植株的馴化再生植株的馴化 ： v5. 5. 再生植株的鑒定：再生植株的鑒定： （植物形態(tài)學(xué)鑒定；細(xì)（植物形態(tài)學(xué)鑒定；細(xì) 胞學(xué)鑒定）胞學(xué)鑒定） v（一）離體繁殖的一般技術(shù)（一）離體繁殖的一般技術(shù) 1.1.外植體的選擇外植體的選擇 (1)(1)根據(jù)培養(yǎng)目的選擇根據(jù)培養(yǎng)目的選擇 (2)(2)考慮種質(zhì)、取材大小、時(shí)期和材料的生理狀考慮種質(zhì)、取材大小、時(shí)期和材料的生理狀 態(tài)，具有代表性態(tài)，具有代表性 v2