第五章 有機(jī)溶劑中的酶催化作用

1、12 用于酶催化的非水介質(zhì)包括： 含微量水的有機(jī)溶劑 與水混溶的有機(jī)溶劑和水形成的均一體系 水與有機(jī)溶劑形成的兩相或多相體系 膠束與反膠束體系 超臨界流體 氣相345有機(jī)介質(zhì)中的酶促反應(yīng)的優(yōu)越性有機(jī)介質(zhì)中的酶促反應(yīng)的優(yōu)越性 原先的認(rèn)識(shí)： 1）我們以前的酶學(xué)理論知道，酶溶解在水溶液中，而且酶一定是在水溶液中才能反應(yīng)，又知道水是個(gè)極性分子，酶只能在極性溶劑中反應(yīng)。 2）我們又知道有機(jī)溶劑是酶的變性劑，用了以后，應(yīng)該在盡可能短的時(shí)間內(nèi)去除有機(jī)溶劑，再把酶溶解于水中，以防止酶的變性和失活。 現(xiàn)在酶工程技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)告訴我們，酶反應(yīng)可在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行，已經(jīng)成為酶工程、酶化工研究的一個(gè)新的領(lǐng)域，開辟了一

2、個(gè)新的研究方向。6有機(jī)介質(zhì)中酶促反應(yīng)優(yōu)越性被認(rèn)為至少有以下優(yōu)點(diǎn)： 1）有利于疏水性底物反應(yīng) 2）提高酶反應(yīng)T，加速反應(yīng)V，提高酶反應(yīng)穩(wěn)定性。 3）可以催化一些在水相中不能進(jìn)行的反應(yīng)。 4）可以改變反應(yīng)的平衡方向。 5）控制底物的專一性。 6）防止由水引起的付反應(yīng)。 7）擴(kuò)大反應(yīng)的pH范圍. 8）有利于酶的固定化。 9）酶、產(chǎn)物容易回收。10）消除底物、產(chǎn)物的抑制作用。11）防止微生物的污染。7第二節(jié)第二節(jié) 反應(yīng)條件：反應(yīng)條件： 一句話，條件要適宜,在一個(gè)特定條件特定條件下進(jìn)行，。 一、一、 保證必需水含量保證必需水含量 水是保證酶催化反應(yīng)的必需條件，活性構(gòu)象是水分子直接或間接由氫鍵等非共價(jià)鍵相

3、互作用來維持。因此與酶分子緊密結(jié)合的一單層水分子對(duì)催化作用非常重要。而其他的水則相對(duì)不那么重要(即由有機(jī)介質(zhì)替代的那部分水不那么重要了）。8 必需水必需水：是維系酶構(gòu)象穩(wěn)定和酶催化活性所必需的那部分最少量的水分子,有時(shí)也叫結(jié)合水結(jié)合水,或者束縛水。束縛水。 只要那部分必需水不丟失只要那部分必需水不丟失, 其他的大部分水可其他的大部分水可以由有機(jī)溶劑代替以由有機(jī)溶劑代替. 所以，有機(jī)介質(zhì)中的酶促反應(yīng)在微觀上看是水的酶反應(yīng)，但是在宏觀上看是有機(jī)介質(zhì)中的酶反應(yīng)。如有的酶反應(yīng)即使水只占0.015%， 酶仍然有活性，可以進(jìn)行酶反應(yīng), 而且反應(yīng)速度非?？?。9 下面是一個(gè)胰脂肪酶的反應(yīng)速度下面是一個(gè)胰脂肪酶

4、的反應(yīng)速度-水含量的關(guān)系水含量的關(guān)系圖。圖。10一般認(rèn)為，一個(gè)酶結(jié)合水的過程分4步：1.首先與酶分子表面的帶電基團(tuán)結(jié)合一部分水(0- 0.07g/g(水/酶)。2.再與酶分子表面的極性基團(tuán)結(jié)合一部分水(0.07-0.25g/g(水/酶)。3.再聚集到表面相互作用較弱的部位(0.25-0.38g/g(水/酶)。4.最后酶分子表面完全水合化，水分子覆蓋酶分子表面。11 一般因酶分子本身, 或溶劑系統(tǒng)不同而有所不同。 如脂肪酶有幾個(gè)水分子, 胰凝乳蛋白酶幾十個(gè)水分子, 乙醇脫氫酶、多酚氧化酶有幾百個(gè)水分子。 另外同一個(gè)酶在不同溶劑系統(tǒng)中含水也不同。 如胰凝乳蛋白酶，在甲苯中，含水0.5%； 氯仿等系

5、統(tǒng)中，含水1.0%，酶活性最高。 一般酶要發(fā)揮它的催化活性，必須與有機(jī)溶劑系統(tǒng)獲得水分以維持酶必要的水合狀態(tài)。12酶選擇原則酶選擇原則： 在有機(jī)介質(zhì)中酶有不變性的潛在能力，即能保持酶催化活性的構(gòu)象和催化能力。 由于酶的組成、結(jié)構(gòu)、構(gòu)象多樣化，所以不能認(rèn)為所有的酶都可以在有機(jī)介質(zhì)中反應(yīng)。 但是，一般現(xiàn)在的資料顯示認(rèn)為大多數(shù)酶可以做到。而有些酶在有機(jī)介質(zhì)中可以進(jìn)行，在水中卻不能反應(yīng)，如脂肪酶、蛋白酶、次黃嘌呤氧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、醛縮酶、多酚氧化酶、醇脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶、ATP酶，膽固醇氧化酶等。這些酶有些屬膜酶，在水溶液中反而不穩(wěn)定。13 酶是否適于在有機(jī)介質(zhì)中反應(yīng)，除與酶性質(zhì)有關(guān)

6、外，還取決于酶-底物、產(chǎn)物-溶劑間的關(guān)系問題。這完全需要用實(shí)驗(yàn)來決定。14 酶在有機(jī)介質(zhì)中的溶解特性、穩(wěn)定性、活性等，對(duì)酶的選擇很重要。1）酶酶00000000粉粉 將酶做成凍干粉，然后在有機(jī)介質(zhì)中充分?jǐn)嚢?，超聲波處理，使得顆粒變小，懸浮于介質(zhì)中。2）控制酶量的問題控制酶量的問題 需要適量。如-凝乳蛋白酶在乙醇中的轉(zhuǎn)脂反應(yīng)，隨著加酶量的下降，活性反而上升，速度快?？赡芾碛煽赡芾碛桑?被認(rèn)為在水含量不變的情況下，酶少到一個(gè)合適的濃度，可以使酶聚合體變小，反而增大了酶-底物接觸的面，減少了底物擴(kuò)散的限制，酶反應(yīng)速度反而加快。153）酶化學(xué)修飾的問題酶化學(xué)修飾的問題 化學(xué)修飾可以改變酶的一些理化性質(zhì)

7、，有利于酶在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性，原先不穩(wěn)定的酶經(jīng)過修飾變得穩(wěn)定，主要是因?yàn)楦淖兞嗣傅囊恍├砘再|(zhì)。 一般認(rèn)為大多數(shù)酶可以在有機(jī)介質(zhì)中反應(yīng)。但是，操作穩(wěn)定性差?；瘜W(xué)修飾的目的就是要提高酶的穩(wěn)定性。16 化學(xué)修飾方法很多，聚乙二醇（PEG）修飾較常見。 如PEG修飾過氧化氫酶，然后在有機(jī)介質(zhì)中活性顯著提高。還研制了磁性脂肪酶（磁性顆粒外包PEG修飾的脂肪酶），它在有機(jī)介質(zhì)中較穩(wěn)定，活力也較高，且可在磁場(chǎng)中回收。還有用谷氨酸、十二醇、葡萄糖酸內(nèi)酯合成了糖脂后修飾超氧化物歧化酶（SOD）。所得的這種SOD糖脂復(fù)合物變成脂溶性的酶，而不是水不溶性的。SOD糖脂復(fù)合物在有機(jī)介質(zhì)中活性高大大高于在水中的活性

8、，并且它對(duì)溫度、pH、蛋白酶水解等的穩(wěn)定性均高于天然SOD。17還有用聚磷酸酯、脂肪酸等修飾SOD，同樣得到了適合于有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行催化反應(yīng)的化學(xué)修飾酶-SOD。在進(jìn)行了不同化學(xué)修飾酶在有機(jī)介質(zhì)中的反應(yīng)的研究以后，發(fā)現(xiàn)化學(xué)修飾（采用脫糖基化、PEG修飾等）能夠增加酶的表面疏水性，而疏水性的增加正是提高酶在有機(jī)介質(zhì)中的溶解性和活力的重要原因。 PEG修飾酶在甲苯中的活性比未修飾酶高16倍。通過酶蛋白甲基化作用或疏水分子對(duì)酶蛋白的修飾，均可提高酶在有機(jī)介質(zhì)中的溶解性、穩(wěn)定性和活性。 184） 固定化酶固定化酶 第二章已經(jīng)講到固定化酶和細(xì)胞的問題，固定化有許多好處。在有機(jī)溶劑中進(jìn)行酶反應(yīng)，如果進(jìn)行酶的

9、固定化，必定可以充分顯示其優(yōu)越性。 酶被吸附或者固定在固相載體（水不溶性）上，就可以對(duì)抗有機(jī)介質(zhì)對(duì)酶的變性能力，提高反應(yīng)的速度和對(duì)熱的敏感性。 一般象用硅膠、硅藻土、玻璃珠等制成固定化酶，載體通過分配效應(yīng)劇烈地改變酶所處的微環(huán)境中底物和產(chǎn)物的局部濃度。固定化后，首先使載體能通過分配效應(yīng)改變酶所處微環(huán)境中底物和產(chǎn)物的局部濃度。 19例子：在水溶液中，底物肉桂醇濃度在0.1mmol/L以上可強(qiáng)烈抑制馬肝醇脫氫酶活性。 現(xiàn)在它在乙酸丁酯中使用親水載體固定化酶，底物濃度高達(dá)50mmol/L也不會(huì)發(fā)生抑制作用。還有個(gè)例子：研究幾種不同載體的固定化脂肪酶時(shí)發(fā)現(xiàn)，疏水性瓊脂珠載體的固定化效果最好。 固定化后

10、脂肪酶在有機(jī)介質(zhì)中的活性比對(duì)應(yīng)酶粉高46.5。 由于載體上疏水基團(tuán)的存在，使疏水性底物在疏水作用下分配到載體周圍的濃度高于反應(yīng)介質(zhì)中的濃度。使酶反應(yīng)速度提高。20 其次，載體影響酶分子上的結(jié)合水。親水性高的載體會(huì)從溶劑和酶分子中奪取大量的水，造成酶部分失水而降低酶的活性；親水性低的載體不足以?shī)Z取酶的必需水，能保持它的高酶活性。 還有通過載體與酶之間形成的多點(diǎn)的結(jié)合作用，可穩(wěn)定酶的催化活性構(gòu)象。例如，-胰凝乳蛋白酶與聚丙烯酰胺凝膠共價(jià)結(jié)合后，在乙醇中的穩(wěn)定性明顯提高，并且對(duì)有機(jī)溶劑的抗性隨酶與載體間共價(jià)鍵數(shù)量的增加而增強(qiáng)。2122 另外載體問題還會(huì)影響酶的動(dòng)力學(xué)。如影響一個(gè)酶同時(shí)催化兩個(gè)反應(yīng)的相

11、對(duì)速度。 在低水活度下把胰凝乳蛋白酶固定在聚酰胺載體AccureI PA6上，水解反應(yīng)被抑制，卻有利于醇解反應(yīng)進(jìn)行。這是固定化后發(fā)生的另外一種情況。 一般來說，載體要選擇疏水性基質(zhì)，目的是為了有利于在有機(jī)溶劑中反應(yīng)。 如用具有高氧滲透性的硅聚合物比較好。 用固定化材料，還應(yīng)考慮載體的酶負(fù)載量、顆粒大小、表面積、內(nèi)部孔徑大小、酶與載體間的相互作用等。 這與前面固定化時(shí)講的要求，出發(fā)點(diǎn)不一樣。231.水溶性有機(jī)溶劑 甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、甘油、正丁醇等2.水不溶性有機(jī)溶劑 石油醚、三氯乙烷、乙酸乙酯、苯、己烷等 在這些酶反應(yīng)溶劑的選擇中，介質(zhì)的組成一般可有四種： 1）單相共溶劑系統(tǒng)（水與能與水

12、相溶的有機(jī)溶劑） 2）雙相溶劑系統(tǒng)（水與跟水不相溶的有機(jī)溶劑） 3）低水有機(jī)系統(tǒng) 4）反向微團(tuán)系統(tǒng)242526在上面四種系統(tǒng)中，1-3用的多原因是： 1）因?yàn)檫@幾個(gè)系統(tǒng)容易建立 2）產(chǎn)物和酶容易回收其中又以低水有機(jī)系統(tǒng)為好，因?yàn)檫m合其中又以低水有機(jī)系統(tǒng)為好，因?yàn)檫m合疏水的有機(jī)溶劑和耐高溫（增加穩(wěn)定性）。疏水的有機(jī)溶劑和耐高溫（增加穩(wěn)定性）。 缺點(diǎn)：擴(kuò)散差，所以反應(yīng)速度慢等。缺點(diǎn)：擴(kuò)散差，所以反應(yīng)速度慢等。 克服的方法： 選用反向微團(tuán)系統(tǒng)。2728那么，有機(jī)溶劑最終是如何影響酶反應(yīng)的？那么，有機(jī)溶劑最終是如何影響酶反應(yīng)的？一般解釋有如下幾種：一般解釋有如下幾種：1）通過底物、產(chǎn)物在水相和有機(jī)溶劑

13、中分配，必然影響到底物、產(chǎn)物在酶必需水在水層中的濃度，這樣，自然影響到酶的反應(yīng)速度。2） 必需水對(duì)特定的酶是一定的。如果有機(jī)溶劑與酶的必需水作用，奪取酶的必需水，一定影響酶的活性。 如果是極性強(qiáng)的有機(jī)溶劑，奪取酶的必需水就多，酶就可能最終失活。 如果是一般的有機(jī)溶劑，奪取酶的必需水不明顯，就最適合酶在這類有機(jī)溶劑中反應(yīng)。 29 有一個(gè)例子十分明顯。 胰凝乳蛋白酶，在辛烷中的反應(yīng)速度比吡啶中 快104倍。酶活性隨著疏水性增加而增加。 3）有機(jī)溶劑本身的影響。 (1)有機(jī)溶劑使底物基態(tài)能級(jí)下降或使酶-底物復(fù)合物能級(jí)升高，從而增大酶反應(yīng)的活化能來降低酶反應(yīng)速度； (2)有機(jī)溶劑分子進(jìn)入酶活性中心，降

14、低活性中心內(nèi)部極性并加強(qiáng)底物與酶之間形成的氫鍵，使酶活性下降； (3)有機(jī)溶劑侵人會(huì)造成酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化，間接改變酶活性中心結(jié)構(gòu)來影響酶活性。30正由于以上原因，正確選擇有機(jī)溶劑顯得十分重要。所以必須考慮以下幾種因素：（1）溶劑與反應(yīng)的相容性。例如，酶催化糖修飾反應(yīng)，必須在親水性的有機(jī)溶劑（加二甲基甲酰胺等）中進(jìn)行。若使用疏水性有機(jī)溶劑，底物不溶解，酶促反應(yīng)不能發(fā)生。（2）溶劑對(duì)主要的反應(yīng)應(yīng)該是惰性的。 （3）溶劑的密度、粘度、表面張力、毒性、廢物的處理和成本等。但是普遍認(rèn)為最佳溶劑因底物而異。 即一種溶劑在辛醇水兩相間分配系數(shù)的常用對(duì)數(shù)值(lgP)。 P大，酶活性大，所需要的水量少。31 后

15、來又有用臨界流體反應(yīng)體系，在產(chǎn)物中不留下任何溶劑。即在臨界溫度、臨界壓力下反應(yīng)。 如用CO2作介質(zhì)，進(jìn)行多酚氧化酶的催化反應(yīng)，反應(yīng)后CO2全部從反應(yīng)體系中自然去除。 還有用超臨界CO2作介質(zhì)，進(jìn)行脂肪酶的催化反應(yīng)，可以把壓力提高到適當(dāng)?shù)臄?shù)值，使轉(zhuǎn)酯反應(yīng)大大加快。3233 圖中表示了與氣相、液相、固相區(qū)相對(duì)應(yīng)的超臨界流體區(qū) 圖中直線表示以CO2的密度為第三參數(shù)的Tp關(guān)系。CO2密度隨壓力與溫度的增減而產(chǎn)生較大的變化。 如溫度為37時(shí)，壓力由7.2MPa（p0.21g/cm3）上升到10.3Mpa（p=0.59g/ cm3），密度增加了2.8倍。 當(dāng)壓力為10.3MPa時(shí)，溫度由92下降到37 ，

16、也可發(fā)生相應(yīng)的密度變化。 在臨界區(qū)的附近，壓力和溫度的微小變化，引起流體的密度大幅度的變化。34 因?yàn)樵谟袡C(jī)介質(zhì)中的最適pH與水溶液中的最適pH的酶反應(yīng)是一樣的，所以在進(jìn)行酶的凍干時(shí)，可以在最適pH的緩沖液中凍干出來，再進(jìn)行有機(jī)系統(tǒng)的反應(yīng)。 這樣，可以使酶在有機(jī)溶劑中反應(yīng)的微環(huán)境具有溶液酶的最適pH環(huán)境。 35總起來講基本上遵循米氏方程的動(dòng)力學(xué)。總起來講基本上遵循米氏方程的動(dòng)力學(xué)。但也有一些影響。但也有一些影響。361）一般被認(rèn)為酶更加穩(wěn)定，因?yàn)閷?duì)熱的穩(wěn)定性提高。 如豬胰脂肪酶在醇和酯中進(jìn)行反應(yīng)，100溫度下反應(yīng),半衰期12小時(shí)以上, 活性比25時(shí)高好幾倍。胰凝乳蛋白酶在60水中，幾分鐘就會(huì)有

17、失活。而在辛烷中，半衰期有幾個(gè)小時(shí)。2）存儲(chǔ)酶的存儲(chǔ)穩(wěn)定性提高胰凝乳蛋白酶20的水中，半衰期只有幾天。而在辛烷中，半衰期有6個(gè)月，活性全部不損失。 37a)單相共溶劑系統(tǒng)中單相共溶劑系統(tǒng)中 對(duì)酶的影響作用主要是如下： 1) 有機(jī)溶劑直接作用于酶，破壞維持酶活性構(gòu)象的氫鍵、疏水鍵、水化層，酶變性失活。 一般有隨著有機(jī)溶劑濃度上升,活性下降的一般規(guī)律。 2)但有些酶，有機(jī)溶劑的濃度上升，酶活性反而上升，到一定濃度， 酶活性達(dá)最高，如再提高濃度，酶活性反而下降。 如胰蛋白酶在1,4-丁二醇中最適濃度80%豬心線粒體ATPase，在乙醇中最適濃度10% EcoRI內(nèi)切酶在甘油中最適濃度為20%38 有

18、些酶反應(yīng)會(huì)發(fā)生變化，如沉淀在玻璃球上的膽固醇氧化酶在有機(jī)溶劑中測(cè)定膽固醇，速度只是水中的1025%。又如酵母醇脫氫酶在1%的水和醋酸丁酯中反應(yīng)，酶活性是水中的1-60%左右。 總之，酶活性隨著水活度的大小而不同，而水活度一定，酶活性會(huì)隨著載體不同而不同，這是一般的規(guī)律。39在這個(gè)系統(tǒng)中有些酶活性會(huì)上升。漆酶（Laccase）與水中的漆酶比較，它水解鄰苯二酚氧化的最大速率，催化活性大100倍以上。分析原因：分析原因： 主要是依賴于微團(tuán)的水化程度，因?yàn)樗c表面活性劑存在的摩爾比大小。反向微團(tuán)脂肪酶的最適水化程度R=9.8。 過氧化物酶、酸性磷酸酶在反向微團(tuán)中的活性 高成萬倍(與水中比)。把活性高于

19、水中的叫超活性超活性40 分析這種現(xiàn)象的理論很多，主要的解釋是： 1）微團(tuán)的水化程度W=水/表面活性劑其水化程度的最佳值與酶活性 最大值成正比例關(guān)系。 2）W值最佳時(shí)，微團(tuán)內(nèi)徑=酶分子直徑，認(rèn)為酶的超活性超活性是由酶分子 外面的表面活性劑這一個(gè)外殼的較大的剛性所引起。41一般產(chǎn)生的專一性減弱，被認(rèn)為由二種原因引起：1)有疏水騷動(dòng)力作用的結(jié)果。2)酶活性中心剛性的增強(qiáng)引起。 例如：脂肪酶是水解脂肪-脂肪酸，而在有機(jī)介質(zhì)中有合成肽鍵的功能。42 水解酶類在水介質(zhì)中，水的濃度為55.5M/L，反應(yīng)是向右，即水解的方向。而在有機(jī)介質(zhì)中，平衡向左，向合成的方向進(jìn)行。而且已經(jīng)應(yīng)用在工業(yè)生產(chǎn)上，如Aspatame(天冬二肽甜味劑)的酶法合成。43 是一種能夠記住酶的活性構(gòu)象的一種能力。枯草桿菌蛋白酶可以從含有競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的水溶液中凍出來，再把抑制劑去除，在辛烷中進(jìn)行酶反應(yīng)，其速度比水溶液中凍出來的活性高100倍。這只要是抑制劑導(dǎo)致酶活性中心構(gòu)象發(fā)生變化，形成高活性的構(gòu)象形式。去除抑制劑后，酶在有機(jī)介質(zhì)中保持酶的高度剛性而得到保持。 舉一個(gè)了例子：正丁醇沉淀 -凝乳蛋白酶和N-乙酰-D-色氨酸間的酶-抑制劑復(fù)合物，凍干轉(zhuǎn)入環(huán)己烷，可以催化合成 N-乙酰-D-色氨酸乙酯。然而