葡萄球菌屬紙片擴(kuò)散法藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、葡萄球菌屬紙片擴(kuò)散法藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1目的規(guī)范葡萄球菌屬紙片擴(kuò)散法藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，確保藥敏結(jié)果的準(zhǔn)確。2適用范圍本操作規(guī)程適用于葡萄球菌屬的細(xì)菌。3選藥原則在本規(guī)程所列受試抗菌藥物主要根據(jù)以下因素選擇。3.1 現(xiàn)行版本的 CLSI M02 和 M100對葡萄球菌屬紙片擴(kuò)散法藥物敏感試驗(yàn)的要求。3.2 本單位處方手冊中的抗菌藥物名冊。3.3 本單位上一年度葡萄球菌屬細(xì)菌耐藥監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)。4質(zhì)控紙片藥敏試驗(yàn)應(yīng)使用金黃色葡萄球菌ATCC25923 和大腸埃希菌ATCC35218（用于 -內(nèi)酰胺 /-內(nèi)酰胺抑制劑合劑） 進(jìn)行質(zhì)量控制， 質(zhì)控菌株可接受的抑菌圈范圍參見現(xiàn)行版本的CLSI M

2、100-A19 。5材料和儀器M-H 培養(yǎng)基，無菌生理鹽水，藥敏紙片，無菌棉簽，35孵育箱，測量尺。6操作步驟根據(jù) CLSI M2-A10 和 M100-S19制定本操作步驟。6.1 菌液制備從孵育了 1824 小時(shí)的非選擇性培養(yǎng)基 （如血瓊脂）平板上，挑取單個(gè)菌落，直接用無菌生理鹽水制成懸液作為接種物，將濁度調(diào)整至0.5 麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)。應(yīng)在接種物制備后15 分鐘內(nèi)接種 M-H 瓊脂平板。用無菌棉拭蘸取菌液，在管內(nèi)壁液面上方旋轉(zhuǎn)緊壓，將多余菌液擠去，然后在瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60以確保接種菌的均勻分布，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。6.2 接種好的平板可敞開蓋子在室溫下干燥35 分鐘（

3、不要超過15 分鐘），然后用紙片分配器將紙片放入瓊脂表面并輕壓，使紙片與瓊脂表面完全接觸。 各紙片中心相距應(yīng)大于24mm，通常 150mm 平板至多放置12 個(gè)紙片， 90100mm平板至多放置 6 個(gè)紙片。由于某些藥物在紙片放入瓊脂平板后幾乎立即擴(kuò)散，所以一旦紙片放入后就不能再移動，若要重新放置， 可用一個(gè)新的紙片放在平板的另一個(gè)位置。6.3 應(yīng)在紙片貼好后15 分鐘內(nèi)將平板倒置放入35孵箱，若超過15 分鐘將使紙片中的抗菌藥物提早擴(kuò)散。 非苛養(yǎng)菌的藥敏解釋性標(biāo)準(zhǔn)是建立在這些菌株在空氣中孵育的基礎(chǔ)上，一些藥物（如氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素）的抑菌圈直徑受 CO2 的影響有較大的改變，所以

4、本菌屬細(xì)菌不能孵育在CO2 孵箱。7判斷標(biāo)準(zhǔn)見表 5-50.表 5-50 葡萄球菌屬細(xì)菌紙片擴(kuò)散試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷標(biāo)準(zhǔn)（ mm）藥敏紙片備注敏感中介耐藥青霉素（10U） 2928參見結(jié)果解釋 9.1、9.3氨芐西林 /舒巴坦（ 10/10 g）15121411參見結(jié)果解釋 9.3頭孢唑林（ 30g）181517 14參見結(jié)果解釋 9.3頭孢西丁（30g）2221金黃色葡萄球菌和鄧葡萄球菌，參見結(jié)果解釋 9.2、 9.32524路鄧葡萄球菌以外的凝固酶陰性的葡萄球菌，參見結(jié)果解釋 9.2、9.3紅霉素（ 15g） 231422 13克林霉素（ 2g） 211520 14參見結(jié)果解釋 9.4替考拉寧

5、（ 30g） 141113 10參見結(jié)果解釋 9.5慶大霉素（ 10g） 151314 12左氧氟沙星（ 5g） 191418 15復(fù)方新諾明（ 1.25/23.75g） 161115 10利福平（ 5g） 201719 16參見結(jié)果解釋 9.6利奈唑胺（ 30g） 21參見結(jié)果解釋 9.78注意事項(xiàng)8.1抑菌圈直徑量取的范圍為包括藥敏紙片在內(nèi)的被藥物完全抑制的區(qū)域（肉眼判斷）。藥敏平板應(yīng)置于無反光的黑色背景下，用反射光源肉眼觀測。但利奈唑胺和苯唑西林紙片應(yīng)使用透射光源進(jìn)行觀測。測量區(qū)域應(yīng)為肉眼觀察無明顯可見菌落生長的區(qū)域， 忽略只有用放大鏡才能觀察到的位于抑菌圈外緣的細(xì)菌菌落。測量復(fù)方磺胺藥

6、敏紙片的抑菌圈時(shí)，可忽略微弱的生長區(qū)域， 而從細(xì)菌明顯抑制處量取抑菌圈直徑。 如在苯唑西林、 利奈唑胺抑菌圈內(nèi)任何可辨別的菌落生長，則報(bào)告該菌株對相應(yīng)抗菌藥耐藥。8.2 在直接從血平板上挑取菌落配制細(xì)菌懸液時(shí)需注意，來自血瓊脂培養(yǎng)基的菌落可能帶有足夠的甲氧芐啶或磺胺拮抗物，因此細(xì)菌可在甲氧芐啶/ 磺胺甲噁唑抑菌圈內(nèi)部沿著敏感菌株的周圍產(chǎn)生模糊生長。8.3MRS檢測的要點(diǎn)提示：用30g頭孢西丁紙片檢測MRS；用直接菌落懸液（ DCS）接種法（而不是生長法） ; 在 3335（不超過 35）、空氣中孵育，金黃色葡萄球菌 18 小時(shí)，凝固酶陰性葡萄球菌 24 小時(shí)；用反射光仔細(xì)查看抑菌圈，如有任何小

7、菌落或薄膜出現(xiàn)均報(bào)告耐藥； 如果懷疑可能為 MRSA, 需用 OXA-Nacl篩選試驗(yàn)確認(rèn)，培養(yǎng)基中必須加Nacl（2%W/V ）；MRS 必須報(bào)告對所有頭孢類和其他 -內(nèi)酰胺類抗菌藥物均耐藥，并提示可能對氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、克林霉素和四環(huán)素等抗菌藥物多重耐藥；攜帶mecA基因，或產(chǎn)生 PBP2a的葡萄球菌菌株，必須報(bào)告為MRS.9結(jié)果分析9.1對于青霉素抑菌圈直徑29mm的菌株，需要檢測該菌株是否產(chǎn)誘導(dǎo)性 -內(nèi)酰胺酶，非產(chǎn)酶菌株才可報(bào)告為敏感，見產(chǎn)色素頭孢菌素試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。9.2 頭孢西丁紙片代替苯唑西林紙片用于試驗(yàn)， 根據(jù)頭孢西丁的試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告苯唑西林的敏感、中介或耐藥。9.3青霉

8、素敏感的菌株對所有青霉素類、- 內(nèi)酰胺類 / -內(nèi)酰胺抑制劑合劑、頭孢菌素、碳青霉稀類敏感； 青霉素耐藥且苯唑西林敏感的菌株對于青霉素酶不穩(wěn)定的青霉素耐藥， 但對青霉素酶穩(wěn)定的青霉素類、-內(nèi)酰胺類 /-內(nèi)酰胺抑制劑合劑、 相關(guān)的頭孢菌素、 碳青霉稀類仍然敏感； 對苯唑西林耐藥的菌株應(yīng)報(bào)告對所有的 -內(nèi)酰胺類耐藥。9.4紅霉素耐藥，克林霉素敏感的菌株應(yīng)檢測菌株對克林霉素的誘導(dǎo)耐藥性，對克林霉素的誘導(dǎo)耐藥性可通過“D”試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)，即將紅霉素和克林霉素紙片間隔 1526mm，35孵育 1618 小時(shí)觀察結(jié)果，如克林霉素抑菌圈在朝向紅霉素紙片的方向出現(xiàn)“D”型變化，該菌株為對克林霉素誘導(dǎo)耐藥的菌株，

9、該菌株對克林霉素的藥敏結(jié)果應(yīng)修正為耐藥。9.5葡萄球菌屬對糖肽類抗菌藥的敏感試驗(yàn)要點(diǎn)提示：紙片擴(kuò)散試驗(yàn)不能區(qū)分對萬古霉素敏感菌株 （MIC 0.5 2g/ml ）與敏感性下降的菌株 （MIC48g/ml ）；須仔細(xì)檢查 MRSA對萬古霉素的MIC；可用與腸球菌同樣的萬古霉素瓊脂做篩選試驗(yàn)，在 35孵育 24 小時(shí)，并同時(shí)用陰性質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC29213作對照，用 VanC 型 VRE 做陽性對照。陽性結(jié)果需用MIC 試驗(yàn)確認(rèn)對 VAN 的MIC ；如出現(xiàn)對萬古霉素敏感性下降的菌株（MIC 4 g/ml ，）應(yīng)該重復(fù)鑒定和藥敏試驗(yàn)，并保留菌種， 送參考實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)； 如果實(shí)驗(yàn)室用自動分析儀做萬古霉素的敏感試驗(yàn)，必須加做CLSI 推薦的 BHI- 萬古霉素（ 6g/ml ）瓊脂篩選試驗(yàn)，或用 CLSI 參考方法或 E 試驗(yàn)測定 MIC；替考拉寧紙片擴(kuò)散試驗(yàn)折點(diǎn)對于將替考拉寧敏感菌株從替考拉寧耐藥或中介的菌株中鑒別出來的能力尚待進(jìn)一步的評估。9.6 利福平不能單獨(dú)用于抗感染治療。9.7 利奈唑胺紙片的抑菌圈應(yīng)用透視光量取，如出現(xiàn)利奈唑胺不敏感的菌株，應(yīng)用 MIC法進(jìn)行確認(rèn)。參考文獻(xiàn)1CLSI.PerformanceStandardsforAntimicrobialSusceptibilityTesting;NineteenthInformationalSuppleme