分子克隆常用載體

1、分子克隆常用載體分子克隆常用載體質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體噬菌體載體噬菌體載體柯斯載體柯斯載體酵母細(xì)胞的克隆載體酵母細(xì)胞的克隆載體一、質(zhì)粒載體理想的質(zhì)粒載體必須具備的基本條件理想的質(zhì)粒載體必須具備的基本條件 1、具有復(fù)制起點(diǎn)、具有復(fù)制起點(diǎn) 2、具有抗菌素抗性基因、具有抗菌素抗性基因 3、具有若干限制酶單一識(shí)別位點(diǎn)、具有若干限制酶單一識(shí)別位點(diǎn) 4、具有較小的分子量和較多的拷貝數(shù)、具有較小的分子量和較多的拷貝數(shù)重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體 psc101質(zhì)粒載體；質(zhì)粒載體； cole 1質(zhì)粒載體；質(zhì)粒載體； pbr322質(zhì)粒載體；質(zhì)粒載體； puc質(zhì)粒載體；質(zhì)粒載體； t載體載體pucm-t質(zhì)

2、粒圖譜pucm-t載體序列二、噬菌體載體二、噬菌體載體噬菌體的生命周期（1 1）溶菌生長(zhǎng)周期噬菌體（烈性）溶菌生長(zhǎng)周期噬菌體（烈性噬菌體）噬菌體）（2 2）溶源生長(zhǎng)周期噬菌體（溫和）溶源生長(zhǎng)周期噬菌體（溫和噬菌體）噬菌體）（1）烈性噬菌體的生活周期（2）溫和噬菌體的生活周期裂解循環(huán)裂解循環(huán)溶源態(tài)溶源態(tài)重要的噬菌體載體一、一、噬菌體載體噬菌體載體（1）插入型載體：有單一酶切點(diǎn),便于外源dna插入 （2）替換型載體，具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間 dna區(qū)段可以被外源插入的 dna片段所取代注意：注意：噬菌載體作為載體，其重組噬菌體噬菌載體作為載體，其重組噬菌體dnadna大小只能：大小只能

3、： 36kb 51kb36kb 51kb。體外包裝：噬菌體載體 + 尾部蛋白 + 頭部蛋白頭部基因（琥珀突變型）尾部基因（琥珀突變型）轉(zhuǎn)錄復(fù)制蛋白質(zhì)合成組裝尾部所需要的組分“無(wú)頭部”的提取物組裝頭部所需要的組分“無(wú)尾部”的提取物溫育轉(zhuǎn)錄復(fù)制蛋白質(zhì)合成體外包裝的重組dna比裸露的dna導(dǎo)入受體細(xì)胞的效率高100-10000倍sup-細(xì)菌完整的噬菌體二、二、m13m13噬菌體載體噬菌體載體m13是絲狀噬菌體，有長(zhǎng)約6500個(gè)核苷酸的閉環(huán)dna基因組。m13附著在大腸桿菌的f性菌毛上，所以它們只能感染雄性細(xì)菌。不過(guò)m13噬菌體dna亦可通過(guò)轉(zhuǎn)染作用導(dǎo)入雌性大腸桿菌細(xì)胞。1.m13噬菌體作為載體優(yōu)越性

4、（1）單鏈dna噬菌體的復(fù)制，是以雙鏈環(huán)形的dna為媒介的，這種復(fù)制形式的dna簡(jiǎn)稱rfdna。（2）不論是rf dna還是ss dna，它們都能轉(zhuǎn)染感受態(tài)的大腸桿菌寄主細(xì)胞。（3）單鏈dna噬菌體顆粒的大小，是受其dna的大小制約的，因此不存在包裝限制問(wèn)題。（4）可產(chǎn)生大量純化的含外源片斷的單鏈dna分子。2.m132.m13載體篩選方法載體篩選方法 插入插入-多肽多肽互補(bǔ)于受體細(xì)胞互補(bǔ)于受體細(xì)胞半乳糖苷酶半乳糖苷酶 未插入未插入-多肽多肽互補(bǔ)于受體細(xì)胞互補(bǔ)于受體細(xì)胞半乳糖苷酶半乳糖苷酶 無(wú)色噬菌斑無(wú)色噬菌斑不分解不分解x-gal(iptg)x-gal(iptg)藍(lán)色色噬菌斑藍(lán)色色噬菌斑分解

5、分解x-gal(iptg)x-gal(iptg) 3.m13噬菌體載體的優(yōu)點(diǎn)與其它載體相比，m13載體具有兩個(gè)十分有用的優(yōu)點(diǎn)：這類載體的基因組中有一條飾變的-半乳糖苷酶基因片段，其中插入了一段具有密集的多克隆位點(diǎn)的序列。m13載體系列是應(yīng)用基因工程技術(shù)成對(duì)地構(gòu)建的，可以有效地克隆雙鏈dna分子的每一條鏈。三、柯斯質(zhì)粒載體三、柯斯質(zhì)粒載體1.柯斯載體的組成柯斯載體的組成 由質(zhì)粒和粘性末端“尾巴”兩部分組成。2 2、cosmidcosmid載體特點(diǎn)：載體特點(diǎn)：（1）具有噬菌體的特性（但因不含噬菌體的全部必需基因，因此不能通過(guò)溶菌周期，無(wú)法形成子代噬菌體顆粒）；（2）具有質(zhì)粒的特性（有質(zhì)粒復(fù)制子及抗菌素基因）；（3）具有高容量的克隆能力（本身僅5-7kb, 克隆極限可達(dá)45kb左右）；（4）具有與同源序列質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。 四、酵母細(xì)胞的克隆載體四、酵母細(xì)胞的克隆載體1 1、整合型載體（、整合型載體（yipyip） yip型載體是由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的dna片段構(gòu)成的。這類載體在細(xì)菌中復(fù)制、擴(kuò)增，進(jìn)入酵母后可整合表達(dá)。yip型載體的特點(diǎn)是轉(zhuǎn)化率低(只有1-10轉(zhuǎn)化子/微克dna)，但轉(zhuǎn)化子遺傳性穩(wěn)定，多用于遺傳分析工作。2 2、復(fù)制型載體（、復(fù)制型載體（yrpyrp） yrp型載體是帶有選擇標(biāo)記和復(fù)制子的酵母的dna片段