羊抗人白蛋白抗體效價(jià)的測定

1、羊抗人白蛋白抗體效價(jià)的測定摘要目的:通過酶免疫吸附實(shí)驗(yàn)間接法對(duì)羊抗人白蛋白抗體的效價(jià)的測定，以判斷是否可以通過本方法對(duì)待測抗體效價(jià)測定。方法：酶免疫吸附實(shí)驗(yàn)間接法，先通過預(yù)實(shí)驗(yàn)探討出最適合的包被抗原人白蛋白的和最適合的兔抗羊血清的最適合濃度，將白蛋白抗原以1:1、1:4、1：8、1：16倍比稀釋，兔抗人血清以1:1000、1：4000、1:8000、1:16000倍比稀釋，待測抗體以1:16、1:64、1:256、1:1024、1：4096倍比稀釋尋找最好的OD值梯度的包被抗原和兔抗羊血清的濃度組，以此濃度組來進(jìn)行待測抗體效價(jià)的測定。結(jié)果：待測抗體通過1:2、1:4、1:8、1:16、1:32

2、、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048、1:4096、1:8192、1:16384倍比稀釋后OD值顯示出明顯的梯度但由于陰性對(duì)照或稀釋比不夠的情況未能檢測出待測抗體的效價(jià)。結(jié)論：酶免疫吸附間接法能對(duì)待測抗體效價(jià)的測定。關(guān)鍵詞ELISA間接法；羊抗人白蛋白；效價(jià)測定前言ELISA法具有較高靈敏度、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、可進(jìn)行定量和半定量測定等優(yōu)點(diǎn)，可以在酶免疫分析儀上做批量檢測。而ELISA間接法常用于檢測人類免疫缺陷病毒（HIV）、丙型肝炎病毒抗體及梅毒螺旋體抗體等IgG類抗體。機(jī)體在外界長期接觸時(shí)會(huì)受環(huán)境刺激產(chǎn)生大量的非特異性IgG類抗體，這些高濃度的非特異

3、性IgG抗體有可能對(duì)固相產(chǎn)生吸附從而產(chǎn)生假陽性反應(yīng)，所以在應(yīng)用此方法進(jìn)行測定時(shí)常需先將樣本做一定的稀釋來避免非特異性IgG抗體對(duì)檢測的干擾1。1.材料與方法1.1試劑：PBS、包被液、封閉液、終止液、洗液、人白蛋白、羊抗人白蛋白抗體、兔抗羊血清、顯色劑A、顯色劑B、陰性對(duì)照液。1.2儀器：酶標(biāo)儀(編號(hào)：20100374 單位：檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心 型號(hào)：Model 680)、微孔洗板機(jī)（編號(hào)：20100373 單位：檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心 型號(hào)：MODEL 1573)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、移液器、一次性試管、移液器槍頭。1.3方法：1.3.1.溶液配置：10*PBS(磷酸二氫鉀:2g；氯化鉀：2g；

4、十二水和磷酸氫二鈉：35.8g；氯化鈉：80g；1000ml蒸餾水)、洗液（PBS1000ml+500ul吐溫20）、包被液（碳酸鈉：1.6g；碳酸氫鈉：2.9g；1000ml蒸餾水）、封閉液（洗液100ml+1g干酪素）終止液（6ml濃硫酸+100ml蒸餾水）、陰性對(duì)照液（人血清2ml+PBS2ml）。1.3.2.預(yù)實(shí)驗(yàn)得到最適合的包被抗原人白蛋白的和最適合的兔抗羊血清的最適合濃度：以包被抗原人白蛋白倍比稀釋包板（過夜），洗滌后加封閉液（熱封閉2h），洗滌后加倍比稀釋的待測抗體和陰性對(duì)照溫育30分鐘，洗滌后加倍比稀釋的兔抗羊血清溫育30分鐘，洗滌后加顯色劑A加顯色劑B溫育15分鐘，加終止液震

5、蕩后在酶標(biāo)液上測定OD值。尋找出最好的OD值梯度的包被抗原和兔抗羊血清的濃度組。如圖1所示：圖1 一抗?jié)舛榷瓜♂屘荻?:161:641:2561:10241:4096陰性1:161:641:2561:10241:4096陰性1234567891011121：1000A1：4000B包被濃度為16ug/ml包被濃度為4ug/ml1：8000C1：16000D1：1000E1：4000F包被濃度為2ug/ml包被濃度1ug/ml1：8000G1：16000H1.3.3.以選好的最好的OD值梯度的包被抗原和兔抗羊血清的濃度組來對(duì)待測抗體效價(jià)的測定：以選好的最好包被抗原人白蛋白的稀釋濃度2ug/ml

6、包板（過夜），洗滌后加封閉液（熱封閉2h），洗滌后加倍比稀釋的待測抗體1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048、1:4096、1:8192、1:16384和陰性對(duì)照液溫育30分鐘，洗滌后加最好的倍比稀釋的兔抗羊血清濃度1:8000溫育30分鐘，洗滌后加顯色劑A加顯色劑B溫育15分鐘，加終止液震蕩后在酶標(biāo)液上測定OD值。如圖2所示圖2： 二抗稀釋梯度 一抗稀釋梯度1:8000ABCDEFGH11:21:41:81:161:321:641:1281:25621:21:41:81:161:321:641:1281:25631

7、:5121:10241:20481:40961:81921:16384陰性對(duì)照陰性對(duì)照41:5121:10241:20481:40961:81921:16384陰性對(duì)照陰性對(duì)照2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為圖3所示：圖3：123456789101112A1.5202.2112.0832.2702.2200.3792.2732.3242.3902.3342.3460.407B1.5481.9651.9691.8841.7150.0961.7201.9151.6811.5691.7230.096C1.5761.8101.4761.2001.4040.0481.9431.6661.3401.3351

8、.2550.061D1.2951.0091.0211.0090.9210.0261.2421.0691.0581.0050.8250.038E2.1421.7022.1202.3082.0660.3262.3101.7751.8841.7711.7790.125F1.9732.1911.9581.5791.6270.1251.7051.8181.5711.4151.3970.111G1.9451.6111.5811.3611.3030.0531.5021.5861.4581.2551.4980.086H1.1941.0031.1940.8960.8660.0251.2821.1601.1911

9、.3010.8380.0402.2待測抗體效價(jià)測定結(jié)果為圖4所示：圖4結(jié)果顯示倍比稀釋后的羊抗人白蛋白抗體OD值顯示出明顯的梯度但由于陰性對(duì)照或稀釋比不夠的情況未能得出待測抗體的效價(jià)。3.討論 酶免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）是1971年由瑞典學(xué)者Engvall和Perlmann及荷蘭學(xué)者VanWeemen和Schuurs建立的。該技術(shù)一經(jīng)問世便迅速發(fā)展成可進(jìn)行液體樣本中微量物質(zhì)測定最簡便易行的實(shí)驗(yàn)方法。本次實(shí)驗(yàn)采用的是酶免疫吸附實(shí)驗(yàn)的間接法，其原理是先將抗原人白蛋白包被于固相載體上，然后加入待測樣本羊抗人白蛋白抗體，如含有特異性抗體就會(huì)形成固相抗原-抗體復(fù)合物，孵育足夠時(shí)間后洗滌，加入酶標(biāo)記抗體

10、兔抗羊抗體，于固相抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合形成固相抗原-抗體-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物，再次孵育洗滌后，加入底物顯色，根據(jù)顏色的深淺確定待測抗體的含量。而我們是對(duì)已知抗體進(jìn)行半定量分析，對(duì)它倍比稀釋后檢測其OD值，當(dāng)稀釋到一個(gè)稀釋比OD值通過陰性對(duì)照計(jì)算得出是陰性結(jié)果時(shí)，那么它上一個(gè)稀釋比就是它的效價(jià)。本次實(shí)驗(yàn)的方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、沒有放射性污染；所用儀器價(jià)廉，易于普及；結(jié)果判斷較客觀，既適合臨床大規(guī)模篩查實(shí)驗(yàn)又可以用于少量標(biāo)本的檢測，但僅適用于個(gè)體的血清或血漿標(biāo)本的檢測，不適合于混合血清或血漿樣本及其他溶液標(biāo)本，對(duì)溶血標(biāo)本、污染細(xì)菌的標(biāo)本及血液沒有完全凝固的血清標(biāo)本會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性2。與

11、直接法相比間接法用不同種抗原包被固相載體后，只需要一種酶標(biāo)記抗人球蛋白抗體，即可進(jìn)行多種抗體的血清學(xué)檢測，具有良好的通用性。本次實(shí)驗(yàn)本應(yīng)該采用的是羊血清作于陰性對(duì)照，可由于條件的限制我們采用的人血清稀釋一倍的陰性對(duì)照大大影響到了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其次我們是組員分工合作，每個(gè)人的加樣手法不一樣導(dǎo)致每一步加樣的量不統(tǒng)一也不準(zhǔn)確而實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性也受到影響，再加上試劑配制時(shí)的誤差最后導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差。預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示當(dāng)包被抗原人白蛋白濃度為2u/g、8u/g和酶標(biāo)二抗兔抗羊1:10000稀釋濃度時(shí)，待測抗體的OD值梯度最明顯、最準(zhǔn)確。利用選好的最適合的包被抗原和酶標(biāo)二抗?jié)舛冉M對(duì)待測抗體測定的OD值我們可

12、以看到明顯的降低梯度，而且到了1:4096、1:8192、1:16384時(shí)梯度最明顯而且降低的OD值差值也越大，可以得出，通過此方法是可以對(duì)待測抗體效價(jià)的測定，可是由于陰性對(duì)照OD值太小不能反應(yīng)羊血清的OD值甚至相差太大，和待測抗體稀釋度還不夠的情況下我們?cè)趯?shí)驗(yàn)結(jié)果中還得不出待測抗體羊抗人白蛋白抗體的效價(jià)，但通過本次實(shí)驗(yàn)達(dá)到了我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。在?shí)驗(yàn)過程中封閉時(shí)我們組員采用的是人工洗板，然而洗滌時(shí)非常重要，在洗滌時(shí)，由于板凹孔容量小，孔間距離近，故每次加入的洗滌液量要即要達(dá)到洗滌充分又要避免相鄰孔內(nèi)液體相互污染，切忌劇烈震蕩。而加樣時(shí)是最重要的，加樣不可太快更不要漏加，要避免加在孔避上部，而且要垂直加樣，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上不的非包被區(qū)易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染，出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異3。這是導(dǎo)致我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果平行對(duì)照的OD值不統(tǒng)一的最大影響因素。通過這次實(shí)驗(yàn)，可以看出準(zhǔn)確的試劑和正確精細(xì)的操作是實(shí)驗(yàn)成功的必要條件，在今后的學(xué)習(xí)和實(shí)驗(yàn)操作過程中，精確的做好每一步才能保證實(shí)驗(yàn)的成功。結(jié)論綜上分析，雖然最后實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒能得到羊抗人白蛋白抗體的效價(jià)，但我們可以得出