NK細胞的研究現(xiàn)狀及應用前景

1、自然殺傷( NK) 細胞是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分,是機體抗御感染和防止細胞惡性轉(zhuǎn)化的重要免疫調(diào)節(jié)細胞。與T 淋巴細胞不同, NK 細胞無需腫瘤特異性抗原識別便可以直接殺傷腫瘤細胞, 是腫瘤免疫治療的重要效應細胞1。人類NK細胞約占全血淋巴細胞的10 %15 %。目前研究認為NK 細胞特異性表達CD56, 而缺乏T 細胞抗原CD3。NK 細胞具有以下功能:( 1) 對病毒感染細胞、白血病細胞及其他腫瘤細胞產(chǎn)生直接細胞毒活性;( 2) 分泌多種免疫調(diào)節(jié)細胞因子( 如:IFN- , TNF- , GM- CSF) ;( 3) 通過細胞膜FcR( CD16)與抗體Fc 段結(jié)合從而介導抗體依賴的細

2、胞毒( ADCC) 作用NK 細胞臨床應用進展2.1 體內(nèi)擴增、激活NK 細胞目前NK 細胞的免疫治療主要是利用細胞因子體內(nèi)擴增、激活NK 細胞和體外產(chǎn)生LAK、CIK 細胞殺傷自體腫瘤細胞。從早期的大劑量IL- 2 治療的嚴重毒副作用到隨后的長期小劑量聯(lián)合間斷中劑量IL- 2 治療證實在HIV 感染及惡性腫瘤患者中可以較好耐受。但這種治療方法只是增強骨髓祖細胞向NK細胞分化及依賴IL- 2 延遲NK 細胞的凋亡, 而并非外周血成熟NK 細胞的增生14, 15。因此聯(lián)合應用IL- 2 和其他細胞因子( 如IL- 12, IL- 15, KL, FL) 可能達到更好的體內(nèi)和體外擴增NK 細胞的效

3、果16, 17。但是由自體腫瘤細胞上表達的MHC- 類分子所介導的抑制性信號仍然是成功治療的最大限制。2.2 體內(nèi)阻滯抑制性受體在自體和HLA 相合的干細胞移植中, 白血病細胞表達MHC- 類分子與NK 細胞的抑制性受體結(jié)合從而抑制NK 細胞對自體白血病細胞的殺傷。Koh 等18最近利用急性白血病小鼠模型證實在體內(nèi)阻滯NK 細胞抑制性受體的可行性。給B6鼠接種C1498( H2d) 鼠的白血病細胞, 利用5E6F( ab') 2 抗Ly49C 和抗體治療可以避免B6 鼠死于白血病, 治療中未發(fā)現(xiàn)明顯的毒副反應及對造血的破壞。另外輸注經(jīng)5E6F( ab') 2體外處理后的IL-

4、2 激活的NK 細胞與未經(jīng)處理的對照組相比可以使小鼠避免因白血病死亡。可以將CD+34細胞與在F( ab') 2作用下活化的NK 細胞共孵育達到體外凈化自體干細胞, 但是人類CD+34細胞對異體反應性NK 細胞的敏感性會限制這種方法的應用。選擇性應用NK 細胞抑制性受體阻滯劑可以增強免疫系統(tǒng)對病毒感染的免疫反應。2.3 調(diào)節(jié)活化性受體及配體正如早期研究證實NK 細胞的功能依賴于相應的抑制性和活化性受體介導的抑制性和活化性信號的平衡。除了可以阻滯抑制性受體, 是否可以利用細胞因子來誘導或上調(diào)NK 細胞表面的活化性受體的表達以打破這種平衡。IL- 2 可以誘導在靜止NK 細胞表面缺乏的自然

5、細胞毒受體NKp44。初步的研究發(fā)現(xiàn)NCR 的表達密度可能是恒定的, 并不受IL- 12, IL- 15,IL- 12, IL- 18 影響1。目前尚未發(fā)現(xiàn)影響NKG2D 表達水平的細胞因子報道。但活化后的NK 細胞表現(xiàn)出的明顯強于未活化的NK 細胞的腫瘤靶細胞殺活性的事實, 預示著調(diào)控NK 細胞表面受體的表達及腫瘤細胞相應配體的表達必將為臨床治療提供新的策略。2.4 同種異體反應性NK 細胞與造血干細胞移植( HSCT)早在2002 年Karre 就已經(jīng)對NK 細胞在促進造血干細胞植入、降低移植物抗宿主病( GVHD) 發(fā)生以及增強移植物抗白血病( GVL) 效應等方面的作用進行了詳細的評述

6、19。當供者NK 細胞的抑制性受體不能與其HLA- 類配體結(jié)合或者與受者的HLA- 類分子不相容時, 同時供受者HLA- 類抗原不合, 就會產(chǎn)生抗白血病的NK 細胞異源反應性。反之如果不存在KIR 獨特型的不相容, 即使HLA 半相合, 供者NK細胞由于結(jié)合抑制性配體而無法產(chǎn)生異源反應性20。Ruggeri 等21分離供受者KIR 獨特型不相容供者的異源反應性NK 細胞, 可以裂解移植前受者來源的經(jīng)PHA 刺激的淋巴細胞和EB 病毒轉(zhuǎn)化的淋巴細胞。另外去除T 淋巴細胞的干細胞移植后可以檢測到早期一過性的供者型NK 細胞的高峰, 包括大量的供者抗受者異源反應性NK 細胞, 并可以持續(xù)到移植后4

7、個月以上。同種異體反應性NK 細胞具有強的GVL 作用卻不會引起GVHD 的發(fā)生。非造血組織缺乏結(jié)合和/ 或激活NK 細胞必需_的配體, 或許這些活化性配體在造血組織和非造血組織的表達差異能夠解釋GVL 發(fā)生的同時而不會發(fā)生GVHD。Ruggeri等22通過輸注大劑量純化的宿主反應性NK 細胞給致死性照射后的鼠, 未見GVHD 發(fā)生。隨后研究發(fā)現(xiàn)異源反應性的NK 細胞可以殺傷宿主的抗原遞呈細胞( antigen present cells, APC)從而抑制GVHD 的發(fā)生, 而且允許20 倍異基因T 細胞輸注劑量的安全。Koehl 等23對3 例多次復發(fā)的ALL 和AML 兒童行干細胞移植后

8、反復輸注純化的KIR 不合的NK 細胞, 在移植后1月內(nèi)3 例患兒達完全緩解和完全供者型, 未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用及GVHD 發(fā)生。NK 細胞的異源反應性不會攻擊除淋巴造血細胞以外的組織細胞, 這使得移植前的異源反應性NK 細胞輸注用作受者預處理是安全的。Ruggeri 等22發(fā)現(xiàn)將雜交小鼠H2d/ b 的同種異體反應性4×106 NK 細胞, 輸注給非致死量照射的H- 2b/ b 小鼠, 可以使H2d/ b 小鼠的骨髓細胞順利植入。而未輸注雜交H2d/ b 鼠的同種異體反應性NK 細胞的H- 2b/ b 鼠排斥H2d/ b 鼠骨髓細胞不能植入。這個試驗證實異體反應性NK細胞在GVH 中

9、的作用可以起到足夠的免疫抑制幫助植入而無GVHD 發(fā)生。因此可以使半相合非清髓移植無需使用嚴重的免疫抑制的預處理而成功植入。2.5 抗CD 抗體活化NK 細胞NK 細胞除接受KAR 和KIR 的配體信號使之處于活化或非活化狀態(tài)外,尚可接受其他活化信號的作用,其中CD 分子就是一組可以挖掘的分子, 以尋求活化整體NK 細胞或清除部分單核細胞后對抗癌、抗病毒或抗自身免疫狀態(tài)的作用24。2.6 同種異體NK 細胞系的治療意義目前在NK 抗腫瘤研究中已經(jīng)建立了人NK- 92, NKL, YT,NK3.3 等NK 細胞系, NK- 92 是唯一進入臨床研究的細胞系。研究發(fā)現(xiàn)NK- 92 幾乎完全缺乏KI

10、Rs 表達, 卻保留有穿孔素和顆粒酶B 介導的細胞毒作用。在體外對多種惡性疾病和異種移植的SCID 小鼠中發(fā)揮重要的抗腫瘤活性25。國內(nèi)的很多學者致力于從NK 細胞腫瘤中篩選細胞株, 在體外培養(yǎng)條件下進行某些細胞因子( SCF, IL- 15, IL- 12, IL- 18, IL- 21 等) 的基因轉(zhuǎn)染, 形成新型治療方案, 對相關(guān)疾病的生物治療有重要意義。3.1 NK 細胞系NK 細胞屬于體積較大的異質(zhì)性的淋巴細胞群體，在免疫監(jiān)視、免疫防御中起著十分重要的作用。隨著細胞克隆化技術(shù)的不斷成熟，相繼報道的NK 細胞系有許多，但是只有6 種來自NK細胞瘤的NK 細胞系是定性的，它們是經(jīng)過單克隆

11、化、可以永久生存的大顆粒淋巴細胞，含有嗜苯胺藍顆粒，胚系TCR 基因，其免疫表型為CD1-，CD2+，sCD3-（2/2 are cyCD3e+），CD4-，CD5-，CD7+，CD8-（1/1 is CD8a+），CD16-，CD25+，CD28+/-，CD56+，CD57-，CD122+，CD132+，TCRab-，TCRgd-。3.1.1 正常NK 細胞來源的NK 細胞系NK3.3 為IL-2 依賴型，具有很強的自然殺傷活性，可以殺傷NK 敏感靶細胞K562，MOLT-4，HSB-2，CEM，BUC，Daudi。其表型為9.6E+，3A1+，HLA-DA+，T200+，T10+T3/Le

12、u4-，T8/Leu2a-，T4/Leu3a-，Leu7-6。3.1.2 惡性變細胞來源的 NK 細胞系（表17）NK-92 細胞是1992 年建立的來自非何杰金淋巴瘤患者的NK 細胞系，由于其免疫表型為CD56brightCD16-，無ADCC 效應，類似于外周血CD56brightNK 細胞。NK-92 是唯一進入臨床研究的細胞系。NK-92 對不同來源腫瘤的細胞系，如白血病、淋巴瘤、惡性黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌等，NK-92 都表現(xiàn)出高效的殺傷活性。研究發(fā)現(xiàn)NK-92 表達大量的活化受體，如：NKp30、NKp46、2B4、NKG2D、E、CD28，而抑制受體的表達卻極少，只有NKGA

13、/B和低水平的KIR2DL4 與ILT-2，缺乏大多數(shù)正常NK 細胞克隆表達的KIRs，如p58 復合體（p58 復合體通過結(jié)合靶細胞上的HLA抗原而抑制NK 細胞的殺傷）7，卻保留有穿孔素和顆粒酶B 介導的細胞毒作用。在體外對多種惡性疾病和異種移植的SCID 小鼠中發(fā)揮重要的抗腫瘤活性。為了使NK-92 更適于臨床應用，Nagashima 等8又成功將IL-2 基因轉(zhuǎn)染到NK-92 細胞中，建立了非IL-2 依賴的NK 細胞，并通過體內(nèi)外實驗證明基因修飾的NK-92 細胞的細胞毒效應明顯高于IL-2 依賴的親代NK-92 細胞，對建立的肝轉(zhuǎn)移癌小鼠也有較強的抗瘤作用。EBV+ 的NK 細胞系

14、HANK-1、NK-YS、SNK-6 的建立有利于探討EBV 在鼻部TNK 細胞淋巴瘤發(fā)病機制中所起的作用。CD21 是已知唯一的病毒受體，Kaneko 等9從一例鼻部TNK 細胞淋巴瘤細胞中以及正常的NK 細胞中均檢測到CD21 的表達，但SNK-6 和NK-YS 卻不表達CD21 受體抗原。因此這兩種細胞系的建立還將有利于研究EBV 感染NK 細胞的途徑以及CD21在病毒感染NK 細胞過程中所起的作用。3.2 NK 細胞抗腫瘤NK 細胞是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是機體抗御感染和防止細胞惡性轉(zhuǎn)化的重要免疫調(diào)節(jié)細胞。與T 淋巴細胞不同，NK 細胞無需腫瘤特異性抗原識別便可以直接殺傷腫瘤細

15、胞，是腫瘤免疫治療的重要效應細胞。一般認為NK 細胞只在腫瘤早期或腫瘤細胞數(shù)量少時發(fā)揮作用，腫瘤晚期或有大量瘤細胞時難以奏效。NK 細胞具有較廣的抗瘤譜。可殺傷同系、同種或異種瘤細胞，其殺傷靶細胞的機制可能是：（1）釋放穿孔素和顆粒酶引起靶細胞壞死或凋亡。NK 細胞和腫瘤細胞接觸幾分鐘后，細胞毒性顆粒的內(nèi)容物被釋放到NK 細胞和腫瘤細胞間的裂隙，這些#NK細胞發(fā)育分化研究取得較大進展，除骨髓、外周血和脾臟外，胸腺、肝臟、淋巴結(jié)等器官中NK細胞前體細胞(NK precursors，NKPs)的分化及其遷移特性引起極大關(guān)注。人類CD56晡咖NK細胞易于在次級淋巴組織及非淋巴組織中聚集，而CD56“”NK細胞則能