紙層析的實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、紙層析的實(shí)驗(yàn)報(bào)告 前言 紙層析法 紙層析法又稱紙色譜法，是目前廣泛應(yīng)用的一種別離技術(shù)。本世紀(jì)初俄國(guó)植物學(xué)家m.tswett發(fā)現(xiàn)并使用這一技術(shù)證明了植物的葉子中不僅有葉綠素還含有其它色素?，F(xiàn)在層析法已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)及其它學(xué)科領(lǐng)域有效的別離分析工具之一。它是一種以紙為載體的色譜法。固定相一般為紙纖維上吸附的水分，流動(dòng)相為不與水相溶的有機(jī)溶劑；也可使紙吸留其他物質(zhì)作為固定相，如緩沖液，甲酰胺等。將試樣點(diǎn)在紙條的一端，然后在密閉的槽中用適宜溶劑進(jìn)行展開。當(dāng)組分移動(dòng)一定距離后，各組分移動(dòng)距離不同，最后形成互相別離的斑點(diǎn)。將紙取出，待溶劑揮發(fā)后，用顯色劑或其他適宜方法確定斑點(diǎn)位置。根據(jù)組分移動(dòng)距

2、離（rf值）與樣比擬，進(jìn)行定性。用斑點(diǎn)掃描儀或?qū)⒔M分點(diǎn)取下，以溶劑溶出組分，用適宜方法定量（如光度法、比色法等）。 紙層析法（paper chromatography）是生物化學(xué)上別離、鑒定氨基酸混合物的常用技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)的氨基酸成分的定性鑒定和定量測(cè)定；也是定性或定量測(cè)定多肽、核酸堿基、糖、有機(jī)酸、維生素、抗菌素等物質(zhì)的一種別離分析工具。紙層析法是用濾 紙作為惰性支持物的分配層析法，其中濾紙纖維素上吸附的水是固定相，展層用的有機(jī)溶溶劑是流動(dòng)相。 在環(huán)境分析測(cè)試中，有時(shí)用紙層析法別離試樣組分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如gc、hplc應(yīng)用普遍。在 做葉綠體色素別離時(shí)用

3、到,將葉片碾碎，浸出綠色液體，將液體與層析液（石油醚）混合，將濾紙一段進(jìn)入混合液體，四種色素在層析液中的溶解度不同，在濾紙上留下4條色素帶。由此觀查出各種色素的相對(duì)含量和種類。 紙層析法一般用于葉綠體中色素的別離，葉綠體中色素主要包括胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a、葉綠素b，它們?cè)趯游鲆褐械娜芙舛炔煌?，溶解度大的隨層析液在濾紙上擴(kuò)散地快，反之那么慢；含量較多者色素帶也較寬。最后在濾紙上留下4條色素帶，所以利用紙層析法 能清楚地將葉綠體中的色素別離。 氨基酸 氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的根本單位，廣泛用于食品、醫(yī)藥、添加劑及化裝品行業(yè)。隨著生物工程技術(shù)產(chǎn)業(yè)的開展逐漸成為2l世紀(jì)全球的主要產(chǎn)業(yè)之一，氨基酸的需

4、求量越來越大，品種變更越來越快，工藝改革越來越新。目前全世界氨基酸每年的產(chǎn)量為100萬噸，而需求總量是800萬噸。我國(guó)自20世紀(jì)60年代起，氨基酸的應(yīng)用在食品工業(yè)占61，在飲料工業(yè)占30，醫(yī)藥、日用化工、農(nóng)業(yè)、冶金、環(huán)保、輕工、生物工程技術(shù)等方面占用的比例逐年增加。 氨基酸在人類生活的很多方面都有著應(yīng)用： (1)在食品行業(yè)的應(yīng)用 (2)在醫(yī)藥工業(yè)的應(yīng)用 (3)在飼料添加劑行業(yè)的應(yīng)用 (4)在化裝品行業(yè)的應(yīng)用 (5)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用 (6)在其他行業(yè)的應(yīng)用 氨基酸工業(yè)還有著廣闊的開展前景： (1)傳統(tǒng)的氨基酸生產(chǎn)方法 (2)運(yùn)用基因工程手段生產(chǎn)氨基酸 (3)大力開展藥用中間體,具體為： 氨基酸及其

5、衍生物逐漸成為藥用中間體 非天然氨基酸是合成活性藥物的重要原料 生產(chǎn)高附加值的非天然氨基酸 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?(1)掌握分配層析的原理，學(xué)習(xí)氨基酸紙層析法的操作技術(shù)（包括點(diǎn)樣、平衡、展層、顯色）。 (2)學(xué)習(xí)樣品的氨基酸成分（水解、層析及鑒定）分析的方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理 (1)紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析。濾紙纖維上的羥基具有親水性，吸附一層水作為固定相，有機(jī)溶劑為流動(dòng)相。當(dāng)有機(jī)相流過固定相時(shí)，物質(zhì)在兩相間不斷分配而得到別離。 (2)溶質(zhì)在濾紙上的移動(dòng)速度用比移值rf值表示。 (3)rf=原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離。 (4)在一定的條件下某種物質(zhì)的rf值是常數(shù)。rf值的

6、大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用紙層析法別離氨基酸。材料與方法 三、實(shí)驗(yàn)裝置與試劑 (1)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液(1mg/ml) 亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。 (2)80%甲醇 (3)0.1%茚三酮丙酮溶液 (4)氨基酸混合液(每種氨基酸500mg/ml) (5)正丁醇 實(shí)驗(yàn)儀器 (1)新華濾紙×1 (2)培養(yǎng)皿×1 (3)電熱鼓風(fēng)枯燥箱×1 (4)吹風(fēng)機(jī)×1 (5)毛細(xì)管×4 （6）針、線、尺×1 （7）鐘罩(高約430mm,直徑約290mm，具磨口塞)×1 實(shí)驗(yàn)操作 (1)濾紙 選

7、用國(guó)產(chǎn)新華 1號(hào)濾紙， 6cm×7cm。在距濾紙2cm處劃線，用 鉛筆在線上標(biāo)上四個(gè)點(diǎn)作為點(diǎn)樣位子（留出縫線空間）。 （2）點(diǎn)樣 點(diǎn)樣要適宜，樣品點(diǎn)的太濃，斑點(diǎn)易擴(kuò)散或拉長(zhǎng)，以致別離不清。用毛細(xì)管吸取氨基酸樣品，與濾紙垂直方向輕輕碰觸點(diǎn)樣處的中心，這時(shí)樣品就自動(dòng)流出。點(diǎn)樣的擴(kuò)散直徑控制在0.5cm之內(nèi)，點(diǎn)樣過程中必須在第一滴樣品干后再點(diǎn)第二滴，為使樣品加速枯燥，可用吹風(fēng)機(jī)吹干，但要注意溫度不可過高，以免氨基酸破壞，影響定量結(jié)果。 將點(diǎn)好樣品的濾紙兩側(cè)比齊，用線縫好，揉成筒狀。注意縫線處紙的兩邊不要接觸。防止由于毛細(xì)管現(xiàn)象使溶劑沿兩邊移動(dòng)特別快而造成溶劑前沿不齊，影響rf值。 (3)展

8、層 將揉成圓筒狀的濾紙放入培養(yǎng)皿內(nèi) (注意濾紙不要碰皿壁)，當(dāng)溶劑展層至距離紙的上沿約1cm時(shí)，取出濾紙，立即用鉛筆標(biāo)出溶劑前沿位置。 酸溶劑系統(tǒng)： 正丁醇： 80%甲酸：水=15:3:2(體積比)，茚三酮2ml。溫度25，時(shí)間1h。 注意：使用的溶劑系統(tǒng)需新鮮配制，并要搖勻。 （4）顯色 待展層根本結(jié)束后, 置65鼓風(fēng)箱中10-20min，鼓風(fēng)保溫，濾紙上即顯出紫紅色/黃色斑點(diǎn)。 （5）rf值的計(jì)算 實(shí)驗(yàn)六 紙層析法觀察轉(zhuǎn)氨基作用 【實(shí)驗(yàn)名稱】：紙層析法觀察轉(zhuǎn)氨基作用 09救援一班 第三大組 李嵐宇 20xx222336 室溫：28° （一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1、學(xué)習(xí)氨基酸紙層析的根本原

9、理。 2、掌握氨基酸紙層析的操作原理。 （二）實(shí)驗(yàn)原理： 轉(zhuǎn)氨基作用是氨基酸代謝過程中的一個(gè)重要反響，在轉(zhuǎn)氨酶的催化下，氨基酸的-酮酸與-酮基的互換反響稱為轉(zhuǎn)氨基作用。轉(zhuǎn)氨基作用廣泛地存在于機(jī)體各組織器官中，是體內(nèi)氨基酸代謝的重要途徑。氨基酸反響時(shí)均由專一的轉(zhuǎn)氨酶催化，此酶催化氨基酸的氨基轉(zhuǎn)移到另一酮基酸上。各種轉(zhuǎn)氨酶的活性不同，其中肝臟的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alt）催化如下反響： 酮戊二酸 + 丙氨酸谷氨酸 + 丙酮酸 本實(shí)驗(yàn)以丙氨酸和-酮戊二酸為底物，加肝勻漿保溫后，用紙層析法檢查谷氨酸的出現(xiàn)，以證明轉(zhuǎn)氨基作用。紙層析屬于分配層析。以濾紙為支持物，濾紙纖維與水親合力強(qiáng)，水被吸附在濾紙的纖維素

10、的纖維之間形成固定相。有機(jī)溶劑與水不相溶，把預(yù)別離物質(zhì)加到濾紙的一端，使流動(dòng)溶劑經(jīng)此向另一端移動(dòng)，這樣物質(zhì)隨著流動(dòng)相的移動(dòng)進(jìn)行連續(xù)、動(dòng)態(tài)的不斷分配。由于物質(zhì)分配系數(shù)的差異，而使移動(dòng)速度就不一樣，在固定相中，分配趨勢(shì)較大的組分，隨流動(dòng)相移動(dòng)的速度就慢，反之，在流動(dòng)相分配趨勢(shì)較大的成分，移動(dòng)速度快，最終不同的組分彼此別離，物質(zhì)在紙上移動(dòng)的速率可以用比值rf表示： alt 物質(zhì)在一定的溶液中的分配系數(shù)是一定的，故比值rf也相對(duì)穩(wěn)定，因此在同一層析體系中可用rf值來鑒定被別離的物質(zhì)。 （三）實(shí)驗(yàn)材料與儀器： 試劑： 1、0.01mol/l ph 7.4磷酸鹽緩沖液。 2、0.2mol/l na2hpo

11、4溶液81ml與0.2mol/l nah2po4溶液19ml混勻,用蒸餾水稀釋20倍。 3、0.1mol/l丙氨酸溶液稱取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/l ph 7.4磷酸鹽緩沖液中,以1.0 n naoh仔 細(xì)調(diào)至ph7.4后, 加磷酸鹽緩沖液至100ml。 4 、0.1mol/l酮戊二酸稱取酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/l ph 7.4磷酸鹽緩沖液中，以1.0 n naoh仔細(xì)調(diào)至ph 7.4 后，加磷酸鹽緩沖液至100ml。 5、0.1mol/l 谷氨酸溶液稱取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/lph 7.4磷酸鹽緩沖液中，以1.0 n na

12、oh仔細(xì)調(diào)至ph 7.4 后, 加磷酸鹽緩沖液至50 ml。 6、0.5%茚三酮溶液稱取茚三酮0.5克于100 ml丙酮中溶解。 7、層析溶劑：將重蒸過的酚2份和水1份按比例混合后，放入分液漏斗中，震蕩，靜置24小時(shí)后分層，將下部酚層轉(zhuǎn)移到瓶中備用。 儀器：玻璃勻漿器、10ml試管、培養(yǎng)皿、外表皿、沸水浴鍋、37恒溫水浴箱、9cm圓濾紙、烘箱、手術(shù)剪刀、分液漏斗。 （四）實(shí)驗(yàn)步驟: 1、肝勻漿制備：取新鮮動(dòng)物肝0.5克,剪碎后放入勻漿器,參加冷0.01mol/lph 7.4磷酸鹽緩沖液1.0 ml,迅速研成勻漿， 用上述緩沖液4.5ml混勻備用。 2、 酶促反響過程 （1）取離心管兩支，編號(hào)：

13、1（測(cè)定管）、2（對(duì)照管），各加肝勻漿0. 5ml。把對(duì)照管放沸水浴中加熱10分鐘，取出冷卻。 （2）各加0.1mol/l丙氨酸0.5 ml, 0.1mol/l-酮戊二酸0.5 ml,0.01mol/l ph 7.4磷酸鹽緩沖液1.5 ml,搖勻。 （3）37保溫，30分鐘后取出，保溫完畢。 （4）把測(cè)定管放沸水浴中煮10分鐘，取出后冷卻，過濾。 3、層析 （1）取圓形濾紙一張（直徑9cm）放潔白紙上，以圓點(diǎn)為中心，約1 cm為半徑,用鉛筆劃一圓線作為基線,在線上四等份處標(biāo)清四點(diǎn)編號(hào)作為點(diǎn)樣原點(diǎn)。 （2）點(diǎn)樣：用四根毛細(xì)玻璃管分別進(jìn)行點(diǎn)樣。把丙氨酸液、谷氨酸液分別點(diǎn)在原點(diǎn)2、4處。把測(cè)定液、對(duì)

14、照液分別點(diǎn)在原點(diǎn)1、3處。注意斑點(diǎn)不宜過大（應(yīng)在直徑0.5cm以下）。在第一次點(diǎn)樣點(diǎn)干后，再在原處同樣點(diǎn)第2次。 （3）層析：先在濾紙圓心處打一小孔（鉛筆芯粗細(xì)），再取濾紙一條卷成捻如燈芯狀,上端插入濾紙中心孔中，下端剪成須狀。 （4）把濾紙平放在上述培養(yǎng)皿上，使紙芯下浸入層析液中，蓋上培養(yǎng)皿蓋。可見層析液沿紙芯上升到濾紙中心，漸向四周擴(kuò)散。當(dāng)層析液前緣到離濾紙邊緣約1cm時(shí)，約25分鐘，取出濾紙，用鑷子小心取下紙芯，放入烘箱中烘干。 （5）顯色：將上述濾紙平放在培養(yǎng)皿上，滴0.5茚三酮的丙酮溶液，使濾紙全部濕潤(rùn)，再放入烘箱枯燥，此時(shí)可見紫色斑出現(xiàn)，比擬色斑的位置，及色澤深淺，計(jì)算rf值，分析是否發(fā)生了轉(zhuǎn)氨基反響。 （五）實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄： （六）實(shí)驗(yàn)討論： 1、從表格（