5凝膠電泳技術(shù)

1、凝膠電泳技術(shù) 電泳（電泳（electroghoresis）：帶電物質(zhì)在電場中向相反）：帶電物質(zhì)在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象電極移動的現(xiàn)象 。電泳技術(shù)就是利用在電場的作用下，由于待分離樣電泳技術(shù)就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對樣品進行分離、鑒定或提純的技術(shù)。而對樣品進行分離、鑒定或提純的技術(shù)。 自由界面電泳沒有固定支持介質(zhì)，所以擴散和自由界面電泳沒有固定支持介質(zhì)，所以擴散和對流都比較強，影響分離效果。于是出現(xiàn)了固定

2、支對流都比較強，影響分離效果。于是出現(xiàn)了固定支持介質(zhì)的電泳，樣品在固定的介質(zhì)中進行電泳過程，持介質(zhì)的電泳，樣品在固定的介質(zhì)中進行電泳過程，減少了擴散和對流等干擾作用。減少了擴散和對流等干擾作用。 凝膠作為支持介質(zhì)的引入大大促進了電泳技術(shù)凝膠作為支持介質(zhì)的引入大大促進了電泳技術(shù)的發(fā)展，使電泳技術(shù)成為分析蛋白質(zhì)、核酸等生物的發(fā)展，使電泳技術(shù)成為分析蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝膠是淀粉凝大分子的重要手段之一。最初使用的凝膠是淀粉凝膠，但目前使用得最多的是膠，但目前使用得最多的是瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。蛋白質(zhì)電泳主要使用聚丙烯酰胺凝膠胺凝膠。蛋白質(zhì)電泳主

3、要使用聚丙烯酰胺凝膠。電泳的基本原理：電泳的基本原理： 在電場中，推動帶電質(zhì)點運動的力（在電場中，推動帶電質(zhì)點運動的力（f）等于質(zhì)點）等于質(zhì)點所帶凈電荷量（所帶凈電荷量（q）與電場強度（）與電場強度（e）的乘積。）的乘積。fqe質(zhì)點的前移同樣要受到阻力（質(zhì)點的前移同樣要受到阻力（f）的影響，對于一個球）的影響，對于一個球形質(zhì)點，服從形質(zhì)點，服從stoke定律，即：定律，即：f6r式中式中r為質(zhì)點為質(zhì)點半徑，半徑，為介質(zhì)粘度，為介質(zhì)粘度，為質(zhì)點移動速度，當(dāng)質(zhì)點在電場為質(zhì)點移動速度，當(dāng)質(zhì)點在電場中作穩(wěn)定運動時：中作穩(wěn)定運動時：ff即即qe6r 球形質(zhì)點的遷移率，首先取決于自身狀態(tài)，即與所球形質(zhì)點的

4、遷移率，首先取決于自身狀態(tài)，即與所帶電量成正比，與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。除了自身帶電量成正比，與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。除了自身狀態(tài)的因素外，電泳體系中其它因素也影響質(zhì)點的電泳狀態(tài)的因素外，電泳體系中其它因素也影響質(zhì)點的電泳遷移率。遷移率。電泳遷移率（電泳遷移率（m）是指在單位電場強度（）是指在單位電場強度（1v/cm）時帶電分子的遷移速度時帶電分子的遷移速度遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比，與分子遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比，與分子的大小和緩沖液的粘度成反比。的大小和緩沖液的粘度成反比。 dna分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動

5、。作用下向正極泳動。 dna分子在凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩分子在凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同效應(yīng)。不同dna的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。 為了獲得好的電泳結(jié)果，應(yīng)盡量減少電荷效應(yīng)，為了獲得好的電泳結(jié)果，應(yīng)盡量減少電荷效應(yīng)，增加分子篩效應(yīng)。增加分子篩效應(yīng)。常用的凝膠電泳有兩類常用的凝膠電泳有兩類 ：瓊脂糖凝膠電泳：分辨率稍低，適于較大分瓊脂糖凝膠電泳：分辨率稍低，適于較大分子子 。聚丙烯酰胺凝膠電泳：分辨率高，適于較小聚丙烯酰胺凝膠電泳：分辨率高，適于較小分子。分子。 一

6、、影響凝膠電泳遷移率的因素一、影響凝膠電泳遷移率的因素 （一）樣品的物理性質(zhì)（一）樣品的物理性質(zhì) 1、分子大小、分子大小 線狀雙鏈線狀雙鏈dna分子長度（堿基對數(shù)目分子長度（堿基對數(shù)目bp）的對數(shù)）的對數(shù)（log10）與遷移距離成反比，以此來測定）與遷移距離成反比，以此來測定dna片段片段（線性雙鏈）的分子量準(zhǔn)確且方便。（線性雙鏈）的分子量準(zhǔn)確且方便。 eb嵌合使遷移率下降嵌合使遷移率下降15%。 當(dāng)當(dāng)dna分子大小超過分子大小超過20kb時，普通瓊脂糖凝膠就時，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴于分子很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，就用瓊脂糖凝

7、膠電泳分離大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離dna時，分子時，分子大小不宜超過此值。大小不宜超過此值。2、分子的空間構(gòu)型：即使分子量相同，構(gòu)型不同，、分子的空間構(gòu)型：即使分子量相同，構(gòu)型不同，其遷移率也不同。其遷移率也不同。 dna分子的空間構(gòu)型分子的空間構(gòu)型對泳動率的影響很大，比對泳動率的影響很大，比如質(zhì)粒分子，泳動率的大小順序為：如質(zhì)粒分子，泳動率的大小順序為：共價閉合環(huán)狀共價閉合環(huán)狀dna（covalently close circular dna，ccc dna，超螺旋構(gòu)型）超螺旋構(gòu)型） ldna（linear form，線型，質(zhì)粒，線型，質(zhì)粒的兩條鏈均斷裂；線性分子）的兩條鏈均斷裂；

8、線性分子）ocdna（開環(huán)（開環(huán)dna，open circulardna，ocdna，它的雙鏈中的一條保它的雙鏈中的一條保持完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，另一條單鏈上有一到幾個切持完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，另一條單鏈上有一到幾個切口）?？冢?。 但是由于瓊脂糖濃度、電場強度、離子強度和但是由于瓊脂糖濃度、電場強度、離子強度和溴化乙錠等的影響，會出現(xiàn)相反的情況。溴化乙錠等的影響，會出現(xiàn)相反的情況。3、帶電量：核酸分子是兩性解離分子，、帶電量：核酸分子是兩性解離分子，ph3.5是堿基是堿基上的氨基解離，而三個磷酸基團中只有一個磷酸解離，上的氨基解離，而三個磷酸基團中只有一個磷酸解離，所以分子帶正電，在電場中向負(fù)極泳動；而所

9、以分子帶正電，在電場中向負(fù)極泳動；而ph8.0-8.3時，堿基幾乎不解離，而磷酸基團解離，所以核酸分時，堿基幾乎不解離，而磷酸基團解離，所以核酸分子帶負(fù)電，在電場中向正極泳動。不同的核酸分子的子帶負(fù)電，在電場中向正極泳動。不同的核酸分子的電荷密度大致相同，因此對泳動速度影響不大。電荷密度大致相同，因此對泳動速度影響不大。 4、堿基組成：、堿基組成： 對遷移率影響不明顯，單鏈對遷移率影響不明顯，單鏈dna形成形成發(fā)頭結(jié)構(gòu)，影響遷移率，單鏈（發(fā)頭結(jié)構(gòu)，影響遷移率，單鏈（1kb）小于雙鏈）小于雙鏈dna（1kb） (二二)支持物介質(zhì)（種類和濃度）支持物介質(zhì)（種類和濃度） 核酸核酸電泳電泳通常使用瓊脂

10、糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠通常使用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種介質(zhì)，瓊脂糖是一種聚合鏈線性分子。含有不同兩種介質(zhì)，瓊脂糖是一種聚合鏈線性分子。含有不同濃度的瓊脂糖的凝膠構(gòu)成的分子篩的網(wǎng)孔大小不同，濃度的瓊脂糖的凝膠構(gòu)成的分子篩的網(wǎng)孔大小不同，適于分離不同濃度范圍的核酸分子。聚丙烯酰胺凝膠適于分離不同濃度范圍的核酸分子。聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺（由丙烯酰胺（acr）在）在n,n,n-四甲基乙四胺四甲基乙四胺（temed）和過硫酸銨（）和過硫酸銨（ap）的催化下聚合形成長）的催化下聚合形成長鏈，并通過交聯(lián)劑鏈，并通過交聯(lián)劑n,n-亞甲雙丙烯酰胺（亞甲雙丙烯酰胺（bis）交叉）交叉連接而成，其網(wǎng)孔的大

11、小由連接而成，其網(wǎng)孔的大小由acr與與bis的相對比例決定。的相對比例決定。 凝膠濃度凝膠濃度 濃度越小，孔徑越大，濃度越大，孔徑濃度越小，孔徑越大，濃度越大，孔徑越小越小 。不同濃度瓊脂糖凝膠的有效分離范圍不同濃度瓊脂糖凝膠的有效分離范圍濃度濃度% %（w/vw/v） 線狀線狀dnadna分子的有效分分子的有效分離范圍（離范圍（kbkb） 0.3560 0.61200.70.8100.90.571.20.46 1.51.23 2.00.12 dna在聚丙烯酰胺凝膠中的有效分離范圍在聚丙烯酰胺凝膠中的有效分離范圍 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 濃度濃度 有效分離范圍（有效分離范圍（bp） 二甲苯青二甲

12、苯青ff 溴酚藍溴酚藍 3.5 10002000 460 100 5.0 80500 260 65 8.0 60400 1604512.0 40200 70 20 15.0 25150 601520.0 6100 4512（三）電場強度（三）電場強度 電場強度是指單位長度（電場強度是指單位長度（cm）的電位降，也稱電勢梯）的電位降，也稱電勢梯度。度。 1-5v/cm（低壓），低壓時，線性（低壓），低壓時，線性dna遷移率與電壓成遷移率與電壓成正比，而對于大片段電泳，甚至用正比，而對于大片段電泳，甚至用0.5-1.0v/cm電泳過電泳過夜。夜。 電場強度愈大，帶點顆粒的泳動越快。但凝膠的有效分電

13、場強度愈大，帶點顆粒的泳動越快。但凝膠的有效分離范圍隨著電壓增大而減小。離范圍隨著電壓增大而減小。高電壓影響凝膠的分離范圍，使分辨率下降：因為高電壓影響凝膠的分離范圍，使分辨率下降：因為隨電壓上升，不同長度隨電壓上升，不同長度dna泳動的增加程度不同，泳動的增加程度不同，凝膠有效分離范圍隨電壓上升而下降凝膠有效分離范圍隨電壓上升而下降 。高壓電泳（高壓電泳（20-600v/cm20-600v/cm（電場強度）（電場強度）,1000-2000v,1000-2000v（電壓）（電壓）, ,必須用必須用pagpag作介質(zhì)。作介質(zhì)。 （四）電泳緩沖液（種類、（四）電泳緩沖液（種類、ph、離子強度）、離

14、子強度） 1、ph值：決定帶電顆粒的解離程度，緩沖液值：決定帶電顆粒的解離程度，緩沖液ph常偏常偏堿性或中性，此時核酸分子帶負(fù)電，向正極移動。堿性或中性，此時核酸分子帶負(fù)電，向正極移動。2、離子強度：離子強度小，溶液的導(dǎo)電性小，帶電、離子強度：離子強度小，溶液的導(dǎo)電性小，帶電顆粒泳動慢顆粒泳動慢 ；離子強度大，溶液的導(dǎo)電性高，帶電顆；離子強度大，溶液的導(dǎo)電性高，帶電顆粒泳動快（過高，產(chǎn)生大量熱，膠熔化，或使粒泳動快（過高，產(chǎn)生大量熱，膠熔化，或使dna變變性。性。 3、種類、種類 ：tae（tris、醋酸、醋酸、edta）：緩沖能力差，電流大易發(fā)）：緩沖能力差，電流大易發(fā)熱，長時間使用陰極為堿

15、性熱，長時間使用陰極為堿性 ，陽極為酸性，陽極為酸性 ，需要循環(huán)使，需要循環(huán)使兩極的兩極的ph一致；但價格便宜。一致；但價格便宜。tbe（tris、硼酸、硼酸、edta）：緩沖能力強。首選）：緩沖能力強。首選tbe。tpe（tris 磷酸，磷酸，edta）：緩沖能力強，但回收）：緩沖能力強，但回收dna 易與易與dna一起沉淀，影響酶反應(yīng)。一起沉淀，影響酶反應(yīng)。tne（tris 醋酸鈉，醋酸鈉，edta）：電流大，適合于長時間低）：電流大，適合于長時間低壓電泳，分辨率高。壓電泳，分辨率高。在緩沖液中加入在緩沖液中加入edtaedta，可以鰲合二價離子，抑制，可以鰲合二價離子，抑制dnasedn

16、ase，保護保護dnadna。 tbe一般配一般配10 或或5 的貯存液，都以的貯存液，都以1tbe作作為使用液進行瓊脂糖凝膠電泳。但為使用液進行瓊脂糖凝膠電泳。但0.5的使用液已具的使用液已具備足夠的緩沖容量；進行聚丙烯酰胺凝膠垂直槽的緩備足夠的緩沖容量；進行聚丙烯酰胺凝膠垂直槽的緩沖液槽較小，沖液槽較小， 故通過緩沖液的電流量通常較大，需要故通過緩沖液的電流量通常較大，需要使用使用1tbe以提供足夠的緩沖容量。以提供足夠的緩沖容量。 tbe溶液長時間存放后會形成沉淀物，為避免這一溶液長時間存放后會形成沉淀物，為避免這一問題，可在室溫下用玻璃瓶保存問題，可在室溫下用玻璃瓶保存5溶液或高壓滅菌

17、。溶液或高壓滅菌。dna電泳帶模糊的原因：電泳帶模糊的原因：1) dna降解，應(yīng)降解，應(yīng) 避免核酸酶污染；避免核酸酶污染；2) 電泳緩沖液陳舊電泳緩沖液陳舊 電泳緩沖液多次使用后，離子強電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，度降低，ph值上升，緩沖能力減弱，從而影響電值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液；泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液； 3) 所用電泳條件不合適所用電泳條件不合適 電泳時電壓不應(yīng)超過電泳時電壓不應(yīng)超過20v/cm，溫度溫度30；巨大；巨大dna鏈電泳，溫度應(yīng)鏈電泳，溫度應(yīng)15；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力

18、；4) dna上樣量過多上樣量過多 減少凝膠中減少凝膠中dna上樣量；上樣量； 5) dna樣含鹽過高樣含鹽過高 電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽；電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽； 6) 有蛋白污染有蛋白污染 電泳前酚抽提去除蛋白；電泳前酚抽提去除蛋白； 7) dna變性變性 電泳前勿加熱，用電泳前勿加熱，用20mm nacl緩沖液稀釋緩沖液稀釋dna。 二、核酸電泳的指示劑與染色劑二、核酸電泳的指示劑與染色劑 核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍（核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍（bromophenol blue, bb）呈藍紫色；二甲苯晴（）呈藍紫色；二甲苯晴（xylene cyanol,

19、xc）呈藍色，它攜帶的電荷量比溴酚藍少，在凝膠中的的呈藍色，它攜帶的電荷量比溴酚藍少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍慢。遷移率比溴酚藍慢。在在0.6%、1%、1.4%和和2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚蘭瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚蘭的遷移率分別與的遷移率分別與1kb、 0.6kb、0.2kb和和0.15kb的雙鏈的雙鏈線性線性dna片段大致相同。片段大致相同。 在在 1%和和1.4%瓊脂糖中電泳瓊脂糖中電泳時，二甲苯青的遷移速率分別與時，二甲苯青的遷移速率分別與2kb和和1.6kb的雙鏈線的雙鏈線性性dna大致相似。大致相似。指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液組

20、成載樣緩沖液（loading buffer）。）。載樣緩沖液的作用：載樣緩沖液的作用：增加樣增加樣 品密度，使其比重增加，以確保品密度，使其比重增加，以確保dna均勻沉均勻沉入加樣孔內(nèi)；入加樣孔內(nèi)；在電泳中形成肉眼可見的指在電泳中形成肉眼可見的指 示帶，可預(yù)測核酸電泳示帶，可預(yù)測核酸電泳的速度和位置；的速度和位置；使樣品呈色，使加樣操作更方便。使樣品呈色，使加樣操作更方便。配方：配方：將將0.25%0.25%溴酚藍、溴酚藍、0.25%0.25%二甲苯青二甲苯青ffff或分別，或分別，或同時加或同時加入或入或30%30%甘油水溶液，或甘油水溶液，或40%40%（w/vw/v）蔗糖水溶液，或）蔗糖

21、水溶液，或15%15%聚蔗糖聚蔗糖(ficoll400)(ficoll400)中。中。（二）染色劑（二）染色劑核酸電泳后，需經(jīng)染色后才能顯現(xiàn)出帶型，最常用的是核酸電泳后，需經(jīng)染色后才能顯現(xiàn)出帶型，最常用的是溴化乙錠染色法，其次是銀染色，目前還有其他不僅安溴化乙錠染色法，其次是銀染色，目前還有其他不僅安全的染色劑。全的染色劑。溴化乙錠（溴化乙錠（ethidium bromide,eb）最常用）最常用260nm，300nm，360nm，發(fā)出，發(fā)出590nm橙紅色。橙紅色。 溴化乙錠含有一個可以嵌入溴化乙錠含有一個可以嵌入dnadna堆積堿基之間的一堆積堿基之間的一個三環(huán)平面基團。它與個三環(huán)平面基團

22、。它與dnadna的結(jié)合幾乎沒有堿基序列特的結(jié)合幾乎沒有堿基序列特異性。在高離子強度的飽和溶液中，大約每異性。在高離子強度的飽和溶液中，大約每2.52.5個堿基個堿基插入一個溴化乙錠分子。當(dāng)染料分子插入后，其平面基插入一個溴化乙錠分子。當(dāng)染料分子插入后，其平面基團與螺旋的軸線垂直并通過范德華力與上下堿基相互作團與螺旋的軸線垂直并通過范德華力與上下堿基相互作用。這個基團的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致用。這個基團的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致與與dnadna結(jié)合的染料呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離溶液中結(jié)合的染料呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離溶液中染料有所增加。染料有所增加。 dnadna吸收

23、吸收254nm254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身吸收合的染料本身吸收302nm302nm和和366nm366nm的光輻射。這兩種情況的光輻射。這兩種情況下，被吸收的能量在可見光譜紅橙區(qū)的下，被吸收的能量在可見光譜紅橙區(qū)的590nm590nm處重新發(fā)處重新發(fā)射出來。射出來。 由于溴化乙錠由于溴化乙錠-dna-dna復(fù)合物的熒光產(chǎn)率比沒有結(jié)合復(fù)合物的熒光產(chǎn)率比沒有結(jié)合dnadna的染料高出的染料高出20-3020-30倍，所以當(dāng)凝膠中含有游離的溴倍，所以當(dāng)凝膠中含有游離的溴化乙錠（化乙錠（0.5ug/ml0.5ug/ml）時，可以檢測到少至）時，

24、可以檢測到少至10ng10ng的的ndanda條條帶。帶。 溴化乙錠可以用來檢測單鏈或雙鏈核酸（溴化乙錠可以用來檢測單鏈或雙鏈核酸（dnadna或或rnarna）。但是染料對單鏈核酸的親和力相對較小，所以）。但是染料對單鏈核酸的親和力相對較小，所以其熒光產(chǎn)率也相對較低。事實上，大多數(shù)對單鏈其熒光產(chǎn)率也相對較低。事實上，大多數(shù)對單鏈dnadna或或rnarna染色的熒光時通過染料結(jié)合到分子內(nèi)形成較短的鏈染色的熒光時通過染料結(jié)合到分子內(nèi)形成較短的鏈內(nèi)螺旋產(chǎn)生的。最低檢出量內(nèi)螺旋產(chǎn)生的。最低檢出量100ng100ng 染色完畢后，通常不需要脫色。但是在檢測小量染色完畢后，通常不需要脫色。但是在檢測小

25、量dna（小于（小于10ng）片段時，通常要將染色后的凝膠進）片段時，通常要將染色后的凝膠進行脫色。行脫色。 eb存在的情況下，線狀存在的情況下，線狀dna的電泳遷移率約降低的電泳遷移率約降低15%，因此，當(dāng)需要知道，因此，當(dāng)需要知道dna片段的準(zhǔn)確大小（如片段的準(zhǔn)確大?。ㄈ鏳na限制酶酶切圖譜的鑒定），凝膠應(yīng)該在無限制酶酶切圖譜的鑒定），凝膠應(yīng)該在無eb情況情況下電泳，電泳結(jié)束后用下電泳，電泳結(jié)束后用eb染色。染色。 eb在凝膠或染色液中的濃度為在凝膠或染色液中的濃度為0.5 g/ml或或0.1 g/ml。注意：注意：eb見光易分解，應(yīng)存棕色試劑瓶中于見光易分解，應(yīng)存棕色試劑瓶中于4下保存下

26、保存。溴化乙錠可以嵌入堿基分子中，導(dǎo)致錯配。溴化乙錠溴化乙錠可以嵌入堿基分子中，導(dǎo)致錯配。溴化乙錠是強誘變劑，具有高致癌性！是強誘變劑，具有高致癌性！核酸吸收核酸吸收260nm紫外線紫外線 ，導(dǎo)致，導(dǎo)致dna的斷裂，因此回收的斷裂，因此回收dna應(yīng)在長波紫外線下觀察較好，以減少對應(yīng)在長波紫外線下觀察較好，以減少對dna的損的損傷傷 。熒光易淬滅，注意觀察的時期，不要反復(fù)在紫外下照熒光易淬滅，注意觀察的時期，不要反復(fù)在紫外下照射。射。由于溴化乙錠具有一定的毒性，實驗結(jié)束后，應(yīng)對含由于溴化乙錠具有一定的毒性，實驗結(jié)束后，應(yīng)對含eb的溶液進行凈化處理再行棄置，以避免污染環(huán)境和的溶液進行凈化處理再行棄

27、置，以避免污染環(huán)境和危害人體健康。危害人體健康。(1) 對于對于eb含量大于含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下處理：的溶液，可如下處理：將將eb溶液用水稀釋至濃度低于溶液用水稀釋至濃度低于0.5mg/ml；加入一倍體積的加入一倍體積的0.5mol/l kmno4，混勻，再加入等，混勻，再加入等量的量的25mol/l hcl，混勻，置室溫數(shù)小時；，混勻，置室溫數(shù)小時；加入一倍體積的加入一倍體積的2.5mol/l naoh，混勻并廢棄。，混勻并廢棄。（2）eb含量小于含量小于0.5mg/ml的溶液可如下處理：的溶液可如下處理： 按按1mg/ml的量加入活性炭，不時輕搖混勻，室溫的量加入活性炭，

28、不時輕搖混勻，室溫放置放置1小時；小時； 用濾紙過濾并將活性碳與濾紙密封后丟棄。用濾紙過濾并將活性碳與濾紙密封后丟棄。銀染：銀染： 銀染色液中的銀離子銀染色液中的銀離子(ag )可與核酸形成穩(wěn)定的可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛 使使ag 還原成銀顆粒，還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺可把核酸電泳帶染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染色。其靈敏度凝膠電泳染色，也用于瓊脂糖凝膠染色。其靈敏度比比eb高高200倍倍.但銀染色后，但銀染色后，dna不宜回收。不宜回收。eb的替代物：的替代物：goldview d

29、na染料是一種可代替溴化乙錠（染料是一種可代替溴化乙錠（eb）的）的新型新型dna染料，使用方法與之完全相同。采用瓊脂糖染料，使用方法與之完全相同。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測凝膠電泳檢測dna時，時，goldview與核酸結(jié)合后能產(chǎn)生與核酸結(jié)合后能產(chǎn)生很強的熒光信號，其靈敏度與很強的熒光信號，其靈敏度與eb相當(dāng)，在某些波段甚相當(dāng)，在某些波段甚至超過至超過eb。在在100ml瓊脂糖膠溶液中加入瓊脂糖膠溶液中加入5l goldview即可，亦可在電泳緩沖液中以同樣比例稀釋后直接使即可，亦可在電泳緩沖液中以同樣比例稀釋后直接使用。在紫外燈下雙鏈用。在紫外燈下雙鏈dna呈現(xiàn)綠色熒光，而單鏈多聚呈現(xiàn)綠色熒光

30、，而單鏈多聚核酸鏈呈紅色熒光。因此，核酸鏈呈紅色熒光。因此，goldview不僅能染雙鏈不僅能染雙鏈dna，也可用于染，也可用于染rna和單鏈和單鏈dna。goldview dna染料在不同的波長下靈敏度有一定影響，建議使用染料在不同的波長下靈敏度有一定影響，建議使用312nm波長。波長。弱點是它的熒光基團在紫外燈下非常容易淬滅，一般弱點是它的熒光基團在紫外燈下非常容易淬滅，一般5-10min條帶就會消失。條帶就會消失。 genefinder具有安全、靈敏等突出優(yōu)點，可以代具有安全、靈敏等突出優(yōu)點，可以代替溴化乙錠替溴化乙錠(eb)作為各種核酸電泳的染色劑。作為各種核酸電泳的染色劑。 與強致癌

31、性的與強致癌性的eb不同，不同，genefinder?屬于花青類染屬于花青類染料，毒性很低，使用安全料，毒性很低，使用安全,可有效保護實驗操作者和環(huán)可有效保護實驗操作者和環(huán)境。境。 genefinder?與與dsdna 結(jié)合熒光信號可增強結(jié)合熒光信號可增強8001000倍，其檢測核酸的靈敏度比倍，其檢測核酸的靈敏度比eb染色法平均高染色法平均高10倍倍左右，與美國左右，與美國molecular probe公司的公司的sybr green i染染料的靈敏度相當(dāng)。料的靈敏度相當(dāng)。genefinder?染料最大吸收峰為染料最大吸收峰為470nm，與該染料結(jié)合的核酸呈現(xiàn)綠色熒光。，與該染料結(jié)合的核酸呈

32、現(xiàn)綠色熒光。gelred tm 是美國是美國 biotium 公最新研制的一種出色的公最新研制的一種出色的紅色熒光核酸染色劑，適用電泳前凝膠染色和電泳后紅色熒光核酸染色劑，適用電泳前凝膠染色和電泳后凝膠染色。與凝膠染色。與 其它核酸染色劑不同，它具備高靈敏度，其它核酸染色劑不同，它具備高靈敏度，高穩(wěn)定性，低毒性和多功能等特性。高穩(wěn)定性，低毒性和多功能等特性。這種染色劑不僅有出色的靈敏度，而且表現(xiàn)出高穩(wěn)定這種染色劑不僅有出色的靈敏度，而且表現(xiàn)出高穩(wěn)定性和廣泛的適應(yīng)性和廣泛的適應(yīng) 性，可用于電泳前染色性，可用于電泳前染色 和電泳后染和電泳后染色色 。 使用紫外透視器在使用紫外透視器在 300nm

33、附近可得到最佳激發(fā)附近可得到最佳激發(fā)效果，在效果，在 595nm 附近附近 顯示紅色發(fā)射光譜顯示紅色發(fā)射光譜 。因此，這。因此，這種染色劑可使用普遍使用的種染色劑可使用普遍使用的 300nm 紫外透視器得到最紫外透視器得到最佳的激發(fā)光譜。佳的激發(fā)光譜。 與與 eb 預(yù)制凝膠不同的是，預(yù)制凝膠不同的是， gelred tm 預(yù)制凝膠預(yù)制凝膠實質(zhì)上并沒有本底熒光，并且對低分子量的實質(zhì)上并沒有本底熒光，并且對低分子量的 dna 片片段也具有極高的靈段也具有極高的靈 敏度。敏度。 和和 eb 一樣，使用一樣，使用 gelred tm 制作的預(yù)制膠可以制作的預(yù)制膠可以長時間貯存確不會降低性能。而長時間貯

34、存確不會降低性能。而 sybrgreen 1 和和 sybr gold 染色劑染色劑 卻不具備這種特性。當(dāng)卻不具備這種特性。當(dāng) gelred tm 用于后制凝膠染色劑時，可以在用于后制凝膠染色劑時，可以在 30 分鐘內(nèi)完全著色，分鐘內(nèi)完全著色，而且因為沒有本底色而免去再進行一次脫色或沖洗而且因為沒有本底色而免去再進行一次脫色或沖洗 的的過程。另外，由于過程。另外，由于 gelred tm 的酸堿水解穩(wěn)定性好，的酸堿水解穩(wěn)定性好，其染色劑可以批量制備以便日后使用。其染色劑可以批量制備以便日后使用。 gelred tm 的另一個重要特性是它比的另一個重要特性是它比 eb 更安全，更安全，但是價格昂

35、貴。但是價格昂貴。三三 凝膠電泳的種類凝膠電泳的種類 （一）瓊脂糖凝膠（一）瓊脂糖凝膠 （agarose gel） 瓊脂糖是從瓊脂（瓊脂糖是從瓊脂（agar)中分離得到，由中分離得到，由1，3連接連接的吡喃型的吡喃型b-d-半乳糖和半乳糖和1，4連接的連接的3，6脫水吡喃型阿脫水吡喃型阿a-l-半乳糖組成，形成相對分子量為半乳糖組成，形成相對分子量為104105的長鏈。的長鏈。瓊脂糖加熱溶解后分子呈隨機線團狀分布，當(dāng)溫度降瓊脂糖加熱溶解后分子呈隨機線團狀分布，當(dāng)溫度降低時鏈間糖分子上的羥基通過氫鍵作用相連接，形成低時鏈間糖分子上的羥基通過氫鍵作用相連接，形成孔徑結(jié)構(gòu)，而隨著瓊脂糖濃度不同形成不

36、同大小的孔孔徑結(jié)構(gòu)，而隨著瓊脂糖濃度不同形成不同大小的孔徑。表徑。表2-1給出了不同濃度凝膠對給出了不同濃度凝膠對dna片段的線性分離片段的線性分離范圍范圍。 由于瓊脂糖凝膠是通過氫鍵的作用，因此過酸由于瓊脂糖凝膠是通過氫鍵的作用，因此過酸或過堿等破壞氫鍵形成的方法常用于凝膠的再溶化，或過堿等破壞氫鍵形成的方法常用于凝膠的再溶化，象象naclo4naclo4能用于凝膠的裂解，一般的凝膠回收試劑能用于凝膠的裂解，一般的凝膠回收試劑盒利用的也是這一原理。盒利用的也是這一原理。隨著實驗技術(shù)的發(fā)展，也針對不同用途開發(fā)了各種類型隨著實驗技術(shù)的發(fā)展，也針對不同用途開發(fā)了各種類型的瓊脂糖凝膠：的瓊脂糖凝膠：

37、（1）低熔點瓊脂糖凝膠，用于）低熔點瓊脂糖凝膠，用于dna片段的回收，且由片段的回收，且由于該種凝膠中無抑制酶，可在膠中進行酶切、連接等；于該種凝膠中無抑制酶，可在膠中進行酶切、連接等；（2）高熔點凝膠，可分離小于）高熔點凝膠，可分離小于1kb的的dna片段，專用于片段，專用于pcr產(chǎn)物的分析；產(chǎn)物的分析；（3）快速凝膠，電泳速度比普通凝膠中快一倍，可節(jié)）快速凝膠，電泳速度比普通凝膠中快一倍，可節(jié)省實驗時間；省實驗時間；（4）適用于）適用于dna大片段的分離。大片段的分離。（5）其它類型。各生產(chǎn)商還開發(fā)很多類型的凝膠，可）其它類型。各生產(chǎn)商還開發(fā)很多類型的凝膠，可根據(jù)實驗要求選擇不同類型的，選

38、擇原則是考慮合適的根據(jù)實驗要求選擇不同類型的，選擇原則是考慮合適的機械強度和熔點。機械強度和熔點。瓊瓊脂脂糖糖/ 標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn) 高高強強度度 低低熔熔點點 低低粘粘度度低低熔熔點點 0.3 0.5 700bp25kb 0.8 500bp15kb 800bp10kb 800bp10kb 1.0 250bp12kb 400bp8kb 400bp8kb 1.2 150bp6kb 300bp7kb 300bp7kb 1.5 80bp4kb 200bp4kb 200bp4kb 2.0 100bp3kb 100bp3kb 3.0 500bp1kb 500bp1kb 4.0 100bp500bp 6.0 10b

39、p100bp （二）聚丙烯胺凝膠電泳（二）聚丙烯胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，page）宜分離鑒定低分子量蛋白質(zhì)、）宜分離鑒定低分子量蛋白質(zhì)、小于小于1kb的的dna片段和片段和dna序列分序列分 析析.其裝載的樣品量其裝載的樣品量大，回收大，回收dna純度高純度高.長度僅相差長度僅相差0.2%(即即500bp中的中的1bp)的核苷酸的核苷酸 分子即能分離。分子即能分離。 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體，在催化劑聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體，在催化劑temed(n，n，n，n一四甲基乙二胺一四甲基乙二

40、胺)和和 過硫酸銨的過硫酸銨的作用下，丙烯酰胺聚合形成長鏈，聚丙烯酰胺鏈在交作用下，丙烯酰胺聚合形成長鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑，聯(lián)劑，n，n一亞甲一亞甲 雙丙烯酰胺參與下，聚丙烯胺鏈雙丙烯酰胺參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠。丙烯酰胺凝膠孔徑的與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠。丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是由丙烯酰胺的濃度決定。大小是由丙烯酰胺的濃度決定。 1、非變性聚丙烯酰胺凝膠：、非變性聚丙烯酰胺凝膠： 在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，dna單鏈的遷移率除與單鏈的遷移率除與dna鏈的長短有關(guān)外，更主鏈的長短有關(guān)外，更主要的是取決于要的是取

41、決于dna單鏈所形成的構(gòu)象。在非變性條件單鏈所形成的構(gòu)象。在非變性條件下，下，dna單鏈可自身折疊形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)單鏈可自身折疊形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。這種構(gòu)象由象。這種構(gòu)象由dna單鏈堿基決定，其穩(wěn)定性靠分子單鏈堿基決定，其穩(wěn)定性靠分子內(nèi)局部順序的相互作用（主要為氫鍵）來維持。相同內(nèi)局部順序的相互作用（主要為氫鍵）來維持。相同長度的長度的dna單鏈其順序不同，甚至單個堿基不同，所單鏈其順序不同，甚至單個堿基不同，所形成的構(gòu)象不同，電泳遷移率也不同。形成的構(gòu)象不同，電泳遷移率也不同。 同等大小的同等大小的dna間的遷移率，由于空間結(jié)構(gòu)影響間的遷移率，由于空間結(jié)構(gòu)影響可相差可相差10%，不能用未變性的聚丙烯胺凝膠電泳判斷，不能用未變性的聚丙烯胺凝膠電泳判斷dna的大小。的大小。（2）變性聚丙烯胺凝膠電泳）變性聚丙烯胺凝膠電泳dna變性：加熱、極端變性：加熱、極端ph、有機溶劑：尿素或甲酰胺、有機溶劑：尿素或甲酰胺導(dǎo)致導(dǎo)致dna解鏈。解鏈。電泳凝膠中進入變性劑：電泳凝膠中進入變性劑：5m的尿素，使的尿素，使dna為單鏈線為單鏈線性，變性性，變性dna的移動速度與其堿基組成和序列幾乎完的移動速度與其堿基組成和序列幾乎完全無關(guān)。