食管癌術(shù)前心臟基因表達(dá)研究及其基因芯片技術(shù)的應(yīng)用與思考

1、             作者：華強(qiáng),楊蟠儲(chǔ),王國(guó)華,郭書(shū)文【關(guān)鍵詞】  心臟；基因表達(dá)；基因芯片技術(shù)           目前,基因芯片技術(shù)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各學(xué)科中,如在基因表達(dá)譜分析、新基因發(fā)現(xiàn)、基因突變及多態(tài)性分析以及疾病的診斷、治療和預(yù)防、藥物篩選、基因測(cè)序等均發(fā)揮著重要的作用1。自1999年基因芯片技術(shù)進(jìn)入心血管系統(tǒng)研究以來(lái)2-3,已在心臟發(fā)育、心肌損傷重塑以及心血管

2、病中西醫(yī)研究中取得了一定成績(jī),但存在的問(wèn)題隨之出現(xiàn),值得深思并深入研究。1  心臟發(fā)育過(guò)程中的基因表達(dá)情況尚未取得一致    了解正常動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中心臟的基因表達(dá)情況及意義,對(duì)心臟疾病的診斷、治療等有重要的價(jià)值。sehl等4比較了13 d胎鼠和出生后1 d乳鼠的基因表達(dá),表明在發(fā)育過(guò)程中,心肌心房鈉尿肽、b-型鈉尿肽、osteopontin、?型膠原、fibronetin等基因表達(dá)發(fā)生了改變,而在心肌缺血損傷重塑過(guò)程中,這些基因也有類(lèi)似的表達(dá)改變。有應(yīng)用超聲心動(dòng)術(shù)檢測(cè)8、10、12周齡wistar大鼠的心臟結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo),同時(shí)應(yīng)用cdna基因芯片技術(shù)觀察

3、心臟基因表達(dá)水平的變化,觀察了大鼠發(fā)育成熟過(guò)程中心臟生長(zhǎng)與心臟基因表達(dá)譜變化的關(guān)系。結(jié)果顯示,大鼠從8周齡生長(zhǎng)至12周齡,體重增加約45.7%,前2周和后2周增加幅度相近；心臟左心室重量和室壁厚度分別增加約27.7%和23.6%,前2周增加幅度明顯大于后2周；基因表達(dá)譜的改變涉及細(xì)胞結(jié)構(gòu)、代謝、氧化應(yīng)激及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多方面基因；10周齡和8周齡比較,變化的基因多數(shù)上調(diào)；12周齡和10周齡比較,基因表達(dá)譜基本又返轉(zhuǎn)至8周齡水平。表明大鼠在成長(zhǎng)期的4周內(nèi)(812周齡),左心室基因表達(dá)譜發(fā)生的變化適應(yīng)生理性心肌生長(zhǎng)需要5。但由于這類(lèi)報(bào)道較少,對(duì)大鼠出生后心臟生長(zhǎng)發(fā)育的研究多為胚胎、新生、成年和老年之間

4、的比較,且每位學(xué)者所研究基因不同,不能形成比較一致的心臟發(fā)育過(guò)程的基因表達(dá)譜,因而對(duì)這些問(wèn)題的證實(shí)需要進(jìn)一步的深入研究,進(jìn)而確定心臟發(fā)育過(guò)程中的基因表達(dá)譜的變化及其意義。2  不同病因所致心肌損傷重塑過(guò)程中的基因表達(dá)各異     就目前文獻(xiàn)研究分析,在心肌損傷重塑過(guò)程中,由于導(dǎo)致?lián)p傷的原因不同,各類(lèi)基因表達(dá)存在明顯不同,同時(shí)所篩選的基因類(lèi)型和數(shù)量不同,導(dǎo)致心肌損傷的表達(dá)基因各異。     張氏等6制備大鼠腹主動(dòng)脈縮窄造成心臟肥厚模型,在縮窄2、4、6周3個(gè)階段中,基因表達(dá)水平連續(xù)發(fā)生變化的基因較少,只有心鈉素前體(anf)和

5、幾個(gè)est,而多數(shù)基因表達(dá)水平的變化僅出現(xiàn)在某一個(gè)特定階段；2周后表達(dá)發(fā)生變化的基因相對(duì)較多,這些基因涉及的功能非常廣泛,包括維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、影響細(xì)胞代謝、介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等,其中能改善血液纖溶狀態(tài)的尿激酶、具有抗氧化功能的超氧化物歧化酶和參與心肌細(xì)胞脂肪酸氧化的長(zhǎng)鏈?；o酶a表達(dá)下降,心肌細(xì)胞骨架蛋白tnt2的表達(dá)也發(fā)生下調(diào),而提示心臟纖維化的細(xì)胞外基質(zhì)?型膠原和參與細(xì)胞增殖的轉(zhuǎn)錄因子p105表達(dá)升高；在4周和6周,上述基因表達(dá)水平的變化都恢復(fù)到正常水平,但又產(chǎn)生了新的基因表達(dá)改變,如在4周非心肌細(xì)胞骨架蛋白smooth muscle actin的表達(dá)上調(diào),亞鐵血紅素氧化酶表達(dá)則下調(diào),而在6周

6、后pkc zeta、cyp450 iia3和脂肪酸氨基水解酶等基因的表達(dá)明顯下調(diào)。同時(shí),在通過(guò)緩釋微泵連續(xù)輸注去甲腎上腺素引起的心肌肥厚研究中,以參與能量代謝的肉毒堿八?；D(zhuǎn)移酶、脂酶和糖原磷酸化酶為例,它們的表達(dá)變化模式較為相似,去甲腎上腺素輸注早期其表達(dá)明顯增高,而后逐漸下降,提示在心肌肥厚早期,心肌細(xì)胞通過(guò)增強(qiáng)脂肪酸代謝和抑制葡萄糖代謝來(lái)增加能量的產(chǎn)生,以適應(yīng)高兒茶酚胺的病理性刺激,而心肌肥厚標(biāo)志性基因心鈉素前體的表達(dá)水平變化則與上述基因完全不同,其表達(dá)變化模式與心肌肥厚的進(jìn)程一致,在心/體比達(dá)到最大時(shí)表達(dá)水平升至最高。此外,當(dāng)心肌肥厚發(fā)展到最高峰時(shí),參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和神經(jīng)遞質(zhì)代謝的物質(zhì)基因

7、表達(dá)水平多發(fā)生變化,提示此時(shí)心肌細(xì)胞生物活動(dòng)旺盛,以適應(yīng)病理刺激。有在應(yīng)用cdna基因芯片對(duì)安靜對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)性心肌肥大組小鼠心肌組織基因進(jìn)行篩選,具有顯著性表達(dá)差異的基因有71條,其中上調(diào)表達(dá)的基因37條,下調(diào)表達(dá)的基因34條。這些基因包括腫瘤相關(guān)基因、細(xì)胞骨架蛋白基因、代謝相關(guān)酶的基因、酪氨酸磷酸酶基因、心肌結(jié)構(gòu)蛋白基因等多種多基因家族編碼的基因,認(rèn)為運(yùn)動(dòng)性肥大心肌是由多基因編碼調(diào)控,并與細(xì)胞代謝、神經(jīng)體液因素的調(diào)控以及心肌收縮蛋白和非收縮蛋白的合成共同參與有關(guān),進(jìn)一步證實(shí)了運(yùn)動(dòng)性心肌肥大相關(guān)基因的多樣性7。以上結(jié)果反映出同樣是心肌肥厚,基因表達(dá)情況大為不同。   

8、60; 缺血、缺氧是燒傷、創(chuàng)傷、手術(shù)、休克等多種病理?xiàng)l件下組織細(xì)胞損害的基本原因之一,然而不同組織細(xì)胞對(duì)缺血、缺氧反應(yīng)的敏感性不同。王氏等8探討嚴(yán)重缺氧后心肌細(xì)胞損害敏感性的分子機(jī)制,其以包含4 096條小鼠基因的dna芯片,檢測(cè)嚴(yán)重缺氧6 h的大鼠心肌和骨骼肌細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因,結(jié)果顯示,嚴(yán)重缺氧6 h后,125條基因在骨骼肌細(xì)胞中存在高表達(dá),111條基因在心肌細(xì)胞中高表達(dá),其中編碼凋亡活化因子mtd、補(bǔ)體c3、血管細(xì)胞粘附分子-1(vcam-1)、-整合素及脂多糖結(jié)合蛋白(lbp)等的基因在心肌細(xì)胞中高表達(dá)。表明嚴(yán)重缺氧6 h后,凋亡活化及炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生在心肌細(xì)胞敏感性損害中發(fā)揮著重要

9、作用。有比較正常大鼠和糖尿病性心肌病大鼠心肌組織中基因表達(dá)的差異,探討糖尿病性心肌病的發(fā)病機(jī)制。結(jié)果顯示：氧化應(yīng)激相關(guān)基因和能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平在糖尿病性心肌病時(shí)明顯下調(diào)；s腺苷蛋氨酸合成酶和精氨酸酶的表達(dá)水平在糖尿病性心肌病時(shí)明顯上調(diào),說(shuō)明氧化應(yīng)激和能量代謝障礙在糖尿病性心肌病發(fā)病機(jī)制中起重要作用；s腺苷蛋氨酸合成酶、精氨酸酶通過(guò)影響糖尿病性心肌病大鼠心肌組織中同型半胱氨酸、一氧化氮的含量在糖尿病性心肌病發(fā)病機(jī)制中起重要作用9。華裔科學(xué)家、美國(guó)哈佛大學(xué)劉宗正教授宣布：他們已確定與心臟衰竭等心血管疾病有關(guān)的26 000多個(gè)基因,已經(jīng)運(yùn)用1萬(wàn)個(gè)左右與心血管疾病有關(guān)基因制成基因芯片,能夠作為

10、診斷心血管疾病的有力工具,但還需要進(jìn)行更多的基因流行病學(xué)研究,才能找到特定疾病與基因間的關(guān)系。同時(shí),由于心臟病的發(fā)生機(jī)率較高,并且引起心臟衰竭的病原較多,主要包括心肌炎、高血壓、糖尿病、心肌梗死、缺氧等,現(xiàn)在雖然已經(jīng)找到200多個(gè)與心臟衰竭有關(guān)基因,但需要進(jìn)一步分析其與哪些病原有關(guān)10。     可見(jiàn),基因芯片技術(shù)篩選運(yùn)動(dòng)性心肌肥大相關(guān)基因具有高通量、高敏度、高效率、大規(guī)模和并行性等優(yōu)點(diǎn)。可是,同是心肌損傷,由于病因不同,同時(shí)研究過(guò)程中所用的手段、所選基因及數(shù)量的不同,得出的特異性表達(dá)基因不同,在應(yīng)用時(shí)較為困難,所以基因芯片技術(shù)在心血管病中的應(yīng)用,仍需大力研究。3

11、  基因芯片技術(shù)在中醫(yī)藥防治心血管病基礎(chǔ)研究中得以嘗試     基因芯片技術(shù)在中醫(yī)藥研究中,亦有從證的研究、復(fù)雜的作用機(jī)理研究、有效藥物篩選及中藥新藥研發(fā)等進(jìn)行了探討,但多局限于研究思路和方法學(xué)探索上,具體研究中存在一些技術(shù)問(wèn)題,理論和方法尚未成熟,仍處于摸索階段11。目前,基因芯片技術(shù)在中醫(yī)藥治療心血管病研究中的報(bào)道有限,王碩仁教授負(fù)責(zé)的課題組利用結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈造成心肌梗死后心衰模型,對(duì)心衰形成期(術(shù)后10 d)、穩(wěn)定期(術(shù)后8周)大鼠的左心室梗死區(qū)、非梗死區(qū)和同期假手術(shù)組的左心室分別取材進(jìn)行了相關(guān)檢測(cè),并觀察了益氣活血復(fù)方的作用。發(fā)現(xiàn)心衰模型大鼠

12、心肌有參與能量代謝、心肌細(xì)胞骨架及纖維等13類(lèi)共1 000余條表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的基因,在梗塞區(qū)差異表達(dá)基因形成期最多(1 086條)、穩(wěn)定期次之(724條),而非梗死區(qū)為形成期最多(196條),穩(wěn)定期較少(97條)。說(shuō)明心肌梗死后心衰是一種多基因病,益氣活血法可能通過(guò)對(duì)心肌梗死后心衰大鼠心臟能量代謝相關(guān)基因的調(diào)節(jié)而改善其功能,起到治療心衰的作用12。此外,有學(xué)者制備了包含87個(gè)心血管疾病相關(guān)基因探針的寡核苷酸芯片,將知母皂苷作用8 h及未作用的培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞提取總rna,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄分別標(biāo)記cy5和cy3熒光染料,然后與芯片雜交,檢測(cè)知母皂苷對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中心血管疾病相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯

13、示,知母皂苷作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞后,血管緊張素酶原(agt)基因、腎上腺素2a受體基因和內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶1基因的表達(dá)均有不同程度的下調(diào),說(shuō)明知母皂苷有調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用,可能是其治療心血管疾病的機(jī)制之一13。可見(jiàn),基因芯片技術(shù)可以用于中藥作用機(jī)理的研究,特別是其高通量、多態(tài)性等特點(diǎn)可能有助于解決中藥作用多靶點(diǎn)的一些問(wèn)題。但通過(guò)對(duì)已研究的資料進(jìn)行分析,具體的基因調(diào)控、基因鑒定及其意義,應(yīng)進(jìn)一步深入分析與研究。     綜上所述,通過(guò)對(duì)近年來(lái)基因芯片技術(shù)在心血管病研究特別是國(guó)內(nèi)的應(yīng)用研究分析,存在一些問(wèn)題,值得思考。如：基因芯片的特異性有待提高。研究論文體現(xiàn)了多種原

14、因均可使不同的大量基因上調(diào)或下調(diào),但這些基因的特異性如何,有待進(jìn)一步鑒定；基因分析方法研究需要加強(qiáng)。如何利用好各種分析方法,進(jìn)行對(duì)上調(diào)或下調(diào)基因進(jìn)行分析,進(jìn)而篩選出有價(jià)值的基因,是一份重要的工作；正常動(dòng)物及模型動(dòng)物基因特異性表達(dá)研究有待加強(qiáng)。形成標(biāo)準(zhǔn)的基因譜,將對(duì)心血管病的診斷、治療及藥物篩選有重要意義。此外,對(duì)樣品制備簡(jiǎn)單化、檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)化等應(yīng)進(jìn)行深入研究,亦是今后研究的重點(diǎn)。相信不久的將來(lái),基因芯片技術(shù)能夠更好、更廣泛地應(yīng)用于心血管病的研究中?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 王 佚.基因芯片技術(shù)及其在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用j.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,27(4)：506508.2 shimket

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