引物設(shè)計原則(最全匯總)

1、引物設(shè)計原則（匯總）普通引物設(shè)計（適用于從載體上擴增模板） ：1. 普通引物長度一般在 20-30bp 之間，常用 24-28bp 左右以保證基因特異性；2. 下載基因序列到 Vector NTI ； 3. 找到所需安裝載體序列； 4. 將基因序列的 CDS 高亮標記；5. 尋找載體序列中常用酶切位點，一般為 EcoRI、 BamHI 、 HindIII 、 XhoI 等等，比對檢測基因序列中是否有這些位點，有的話舍棄，最后選擇兩個酶切位點，最好離得遠一點， 并且最好 buffer 用一樣的。酶切位點一般是6bp 的回文序列；6. 從基因 ATG 開始往后選擇 10-20bp 均可 （我的習(xí)慣

2、是27bp-6bp 酶切位點 -2bp 保護堿基 -xbp補齊序列） ，但最好保證最后兩個是G 或者 C ，以減少錯配率；7. 將上游酶切位點序列補在 ATG 前方，并根據(jù)載體對框情況補足兩者之間的空缺，再根據(jù)序列的 GC 含量和 TM 值在酶切位點前補足保護堿基，以保證 GC 和 AT 的含量不能過高。注意，所有的補齊不能用到終止密碼子；8. 檢測上游序列的結(jié)構(gòu)情況，理論上不要太多二級結(jié)構(gòu)以及3 端匹配即可；不過重復(fù)的序列也不能太多，以免移碼；9. 從下游終止密碼子開始向前選擇 10-20bp 均可， 但最好保證最后兩個是G 或者 C， 以減少錯配率；10. 選才Co complementa

3、ry sequence,在N端補齊下游酶切位點，如果 tag在C端（即下游），則在第 9 點中應(yīng)該從終止密碼子前開始選擇 （即舍棄終止密碼子） ， 并且下游引物也要對框，如果 tag 在 N 端，則下游引物不需要對框，只要在N 端加上下游酶切位點，再根據(jù)情況加上 2 個保護堿基，然后檢測二級結(jié)構(gòu)，原則上3 端部匹配即可。不過重復(fù)的序列也不能太多，以免移碼；11. 將設(shè)計好的上下游引物放在一起檢測二級結(jié)構(gòu)，原則上3 端部匹配即可。不過重復(fù)的序列也不能太多，以免移碼；12. 最后在 NCBI 的 primer Blast 網(wǎng)站上比對引物序列，看是否基因特異性的。2011 年 10 月 18 日左潔

4、1. 引物的長度一般為 15-30 bp ，常用的是 18-27 bp ，但不應(yīng)大于38，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74C,不適于Taq DN咪合酶進行反應(yīng)。2. 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當沒有相似性較高，尤其是3 端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯配。引物3'端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如 GGG£ CCC也會 使錯誤引發(fā)機率增加。3,引物3'端的末位堿基對Taq酶的DN給成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴增效率， 末位堿基為 A 的錯配效率明顯高于其他3個堿 基， 因此應(yīng)當避免在引物的3端使用堿基A。 另外， 引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR5

5、應(yīng)失敗。5'端序列對PCF®響不太大，因此常用來引進修飾位 點或標記物。4,引物序列的GC含量一般為40-60%,過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游 引物的G*量不能相差太大。5,引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm值在72c左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計 算有多種方法，如按公式Tm= 4（G+C）+ 2（A+T）,在Oligo軟件中使用的是最鄰 近法 （the nearest neighbor method） 。6. AG值是指DNA（鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的 相對穩(wěn)定性。應(yīng)當選用3'端AG值較低（絕又t值不超過9）,而5'端和中間 AG

6、值相對較高的引物。引物的3'端的AG值過高，容易在錯配位點形成雙鏈 結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNAK合反應(yīng)。7. 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5kcal/mol ）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使 PC阪應(yīng)不能正常進行。8. 對引物的修飾一般是在5端增加酶切位點，應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。引物序列應(yīng)該都是寫成5-3 方向的，Tm之間的差異最好控制在1度之內(nèi)，另外我覺得擴增長度大一些比較好，500bp左右。要設(shè)計引物首先要找到DNAf列的保守區(qū)。同時應(yīng)預(yù)測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結(jié)構(gòu)。 如這個區(qū)域單鏈能形成二級結(jié)構(gòu)， 就要避開它。 如這

7、一段不能形成二級結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計引物。 引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。 產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。 引物長度一般在1530堿基之間。 G+*量在40%60無間。 堿基要隨機分布。 引物自身不能有連續(xù)4 個堿基的互補。 引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。 引物5'端可以修飾。 引物3'端不可修飾。 引物3'端要避開密碼子的第3位。1. 引物的特異性 引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源。2 .避開產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)區(qū) 某些引物無效的主要原因是引物重復(fù)區(qū) DNAZ級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計算機軟件

8、可以預(yù)測估計mRNA勺穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)， 有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域 自由能（ G° ）小于58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一 區(qū)域時，用7-deaza-2'-脫氧GTPWt dGTP寸擴增的成功是有幫助的。3 .長度 寡核甘酸引物長度為1530bp, 一月殳為2027mes引物的有效長度： Ln=2（G+C） +（A+T），Ln 值不能大于38，因為>38 時，最適延伸溫度會超過Taq DNA聚合酶的最適溫度（74c）,不能保證產(chǎn)物的特異性。4 .G+C含量G+C含量一般為40%60%其Tm值是寡核甘酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50

9、%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度， 一般高于Tm值510Co若按公式Tm=4（G+C +2 （A+T）估計引物的Tm值，則有效引 物的Tm為5580C,其Tm值最好接近72 c以使復(fù)性條件最佳。5 . 堿基礎(chǔ)隨機分布 引物中四種堿基的分布最好是隨機的， 不要有聚嘌呤或聚喀噬的存在。尤其3'端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C,因這樣會使引物在G+C 富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。6 . 引物自身 引物自身不應(yīng)存在互補序列， 否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。 這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自 身連續(xù)互補堿基不能大于3bp。 7. 引物之間 兩引物之

10、間不應(yīng)不互補性，尤應(yīng)避免 3'端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應(yīng)多于4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。8.引物的3'端 引物 的延伸是從3'端開始的，不能進行任何修飾。3'端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCRAS-PCR反應(yīng)中，引物3'端不能發(fā)生錯 配。在 標準PCR5應(yīng)體系中，用2U Taq DN咪合酶和800 mol/L dNTP（四種dNTP 各 200仙 mol/L）以質(zhì)粒（103拷貝）為模板，按 95C , 25s； 55C , 25s； 72C, 1min的循環(huán)參數(shù)擴增HIV- 1 gag基因區(qū)的條件下，引物3'

11、端錯配對擴增產(chǎn) 物的影響是有一定規(guī)律的。A： A錯配使產(chǎn)量下降至1/20 , A： G和C： C錯七 下降至1/100。引物A:模板G與引物G模板A錯配對PCR響是等同的。9.引物的5'端 引物的5'端限定著PCRT物的長度，它對擴增特異性影響 不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物 5'端修飾包括：加 酶切位點；標記生物素、熒 光、地高辛、Eu3將；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNAff列； 引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。 10. 密碼子的 簡并 如擴增編碼區(qū)域，引物3'端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的 第 3 位易發(fā)生簡并，會影響擴

12、增特異性與效率。Hairpin 發(fā)卡結(jié)構(gòu)如果自由能值大于 0 則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定從而不會干擾反應(yīng)如果自由能值小于 0 則該結(jié)構(gòu)可以干擾反應(yīng)二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向。引物之間形成如果配對區(qū)域在3 末端問題會更為嚴重 3 末端配對很容易引起引物二聚體擴增使Pair Rating 匹配度評分匹配度低的引物對常常不太有效是因為在同樣退火溫度下TM氐的引物決定擴增的特異性而Tm高的引物更易于形成非特異性結(jié) 合而造成錯誤的起始【 1】引物的長度以 15 30bp 為宜，否則會影響擴增的特異性。2堿基盡可能隨機分布，避免相同的堿基成串排列，引物的 G+輸量 在40% 60%之間，若G+若量太低，可

13、在5"端加上一些G或C,若G+ C 含量太高，可在5"端加上一些A或T?！?3】 應(yīng)避免每條引物內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)及兩條引物的 3" 端互補形成引物二聚體，避免在引物的3"端有3個G或3個C成串排列，3"端的末位堿基最好 選T、C、G,而不選A,也有建議在引物的兩端用12個喋吟堿基。4盡可能使用兩條引物的Tm值相同（最好相差不要超過5C）,退火溫 度根據(jù)較低的Tm值選定，也可以通過改變引物的長度來平衡兩條引物的退火 溫度。Tm值可以根據(jù)Tm=4（G+C）+2（A+T計算。而對于較長的引物，Tm值需 要考慮動力學(xué)參數(shù)、從“最近鄰位”的計算方式得到，

14、現(xiàn)有的PCRSI物設(shè)計軟件大 多數(shù)都采用這種方式。（注：對于 Tm值的計算有爭議的地方是附加 序列應(yīng)不應(yīng)該計算在內(nèi)，我覺得有值得商討的地方。因為從理論上只有最開始的循環(huán)引物的附加 序列是不與模板鏈結(jié)合的，而在后來的PCRS應(yīng)中，引 物的附加序列是和模板鏈結(jié)合了的。）【 5】 引物的3端要與模板嚴格配對，而 5端堿基沒有嚴格的限制，只要與模板DN閣合的部分足夠長，其5'端堿基可不與模板DNA!己對而呈游離 狀態(tài)，這樣， 我們可以在引物的 5 末端加上酶切位點（引入酶切位點時，要考慮到進行雙酶切的共用緩沖液，否則給下游工作帶來困難）、啟動子，方便下游操作?！?6】 不要在擴增序列的二級結(jié)構(gòu)

15、區(qū)設(shè)計引物，以免退火困難。也要考慮引物設(shè)計處模板的特異性。引物設(shè)計原則1 .引物的長度一般為15-30 bp,常用的是18-27 bp,但不應(yīng)大于38,因為過長 會導(dǎo)致其延伸溫度大于74C,不適于Taq DNA聚合酶進行反應(yīng)。2 .引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當沒有相似性較高，尤其是3'端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯配。引物3'端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC,也會使 錯誤引發(fā)機率增加。3 .引物3'端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿 基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應(yīng)當避免在引物的3&#

16、39;端使用堿基Ao另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu) 也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5'端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾 位點或標記物。4 .引物序列的GC含量一般為40-60%,過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游 引物的GC含量不能相差太大。5 .引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm值在72c左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計 算有多種方法，如按公式Tm = 4(G+C) + 2(A+T),在Oligo軟件中使用的是最鄰 近法(the nearest neighbor method)6 .是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當選用3'端AG值較

17、低(絕對值不超過9),而5'端和中間AG 值相對較高的引物。引物的3'端的AG值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并 引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。7 .引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高(超過 4.5kcal/mol)易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚 體帶，并且降低引物有效濃度而使 PCR反應(yīng)不能正常進行。8 .對引物的修飾一般是在5'端增加酶切位點，應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。引物序列應(yīng)該都是寫成5-3方向的，Tm之間的差異最好控制在1度之內(nèi)，另外我覺得擴增長度大一些比較好，500bp左右。要設(shè)計引物首先要找到 DNA 序列的保守區(qū)。同時應(yīng)預(yù)測將要擴增的片段單鏈是

18、否形成二級結(jié)構(gòu)。 如這個區(qū)域單鏈能形成二級結(jié)構(gòu)， 就要避開它。 如這一段不能形成二級結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計引物。 引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。 產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。 引物長度一般在1530堿基之間。 G+C 含量在40%60%之間。 堿基要隨機分布。 引物自身不能有連續(xù)4 個堿基的互補。 引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。引物5端可以修飾。引物3端不可修飾。 引物3端要避開密碼子的第3位。1 .引物的特異性引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8 個互補堿基同源。2 .避開產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)區(qū)某些引物無效的主要原因是引物重復(fù)區(qū) DNA 二級結(jié)構(gòu)的影響， 選擇擴增片

19、段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。 用有關(guān)計算機軟件可以預(yù)測估計 mRNA 的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（ G° ）小于 58.6lkJ/mol 時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza2-脫氧GTP取彳t dGTP對擴增的成功是有幫助的。3 .長度寡核苷酸引物長度為1530bp， 一般為2027mer。 引物的有效長度：Ln=2（ G+C） + （ A+T ）， Ln 值不能大于38，因為>38 時，最適延伸溫度會超過TaqDNA 聚合酶的最適溫度（74）,不能保證產(chǎn)物的特異性。4 .G+C含量G+C含量一般為40%60%。其Tm值是寡

20、核甘酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下， 50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高于Tm 值 510。若按公式Tm=4 （G+C） +2 （A+T ）估計引物的Tm 值，則有效引物的Tm 為 5580，其Tm 值最好接近72以使復(fù)性條件最佳。5 .堿基礎(chǔ)隨機分布引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧噬的存在。尤其3'端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C,因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。6 .引物自身引物自身不應(yīng)存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。 這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。 若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補堿基不能

21、大于3bp。7 .引物之間兩引物之間不應(yīng)不互補性，尤應(yīng)避免3端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應(yīng)多于 4 個連續(xù)堿基的同源性或互補性。8 .引物的3端 引物的延伸是從3端開始的，不能進行任何修飾。3端也不能有形 成任何二級結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的 PCR （AS-PCR）反應(yīng)中，引物3'端不能發(fā)生 錯配。在標準PCR反應(yīng)體系中，用2U Taq DNA聚合酶和800仙mol/L dNTP（四 種dNTP各200仙mol/D以質(zhì)粒（103拷貝）為模板，按95 C, 25s； 55C, 25s； 72 C, 1min的循環(huán)參數(shù)擴增HIV-1 gag基因區(qū)的條件下，引物3端錯配對擴增產(chǎn)

22、 物的影響是有一定規(guī)律的。A ： A錯配使產(chǎn)量下降至1/20, A ： G和C ： C錯七 下降至 1/100。 引物 A ： 模板 G 與引物 G： 模板 A 錯配對 PCR 影響是等同的。 9. 引物的5端 引物的5'端限定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴增特異性影響不大。因 此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5'端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點、 插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。10.密碼子的簡并如擴增編碼區(qū)域，引物3'端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影 響擴增特

23、異性與效率。Hairpin 發(fā)卡結(jié)構(gòu)如果自由能值大于 0 則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定從而不會干擾反應(yīng)如果自由能值小于 0 則 該結(jié)構(gòu)可以干擾反應(yīng)二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向。引物之間形成如果配對區(qū)域在3末端問題會更為嚴重3 末端配對很容易引起引物二聚體擴增使Pair Rating 匹配度評分匹配度低的引物對常常不太有效是因為在同樣退火溫度下 Tm 低的引物決定擴增的特異性而Tm 高的引物更易于形成非特異性結(jié)合而造成錯誤的起始【 1】引物的長度以15 30bp 為宜，否則會影響擴增的特異性?！?2】 】堿基盡可能隨機分布，避免相同的堿基成串排列，引物的 G+C 含量在40% 60%之間，若G+C含

24、量太低，可在5'端加上一些G或C,若G+C含量 太高，可在5'端加上一些A 或 T ?！?3】 應(yīng)避免每條引物內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)及兩條引物的 3'端互補形成引物二聚體，避免在引物的 3'端有 3 個 G 或 3 個 C 成串排列，3'端的末位堿基最好選T 、C、G,而不選A,也有建議在引物的兩端用12個喋吟堿基。【 4】 盡可能使用兩條引物的 Tm 值相同（最好相差不要超過5），退火溫度根據(jù)較低的 Tm 值選定，也可以通過改變引物的長度來平衡兩條引物的退火溫度。 Tm 值可以根據(jù)Tm=4（G+C）+2（A+T） 計算。而對于較長的引物， Tm 值需要考慮動

25、力學(xué)參數(shù)、從 “最近鄰位 ”的計算方式得到，現(xiàn)有的 PCR 引物設(shè)計軟件大多數(shù)都采用這種方式。 （注：對于Tm 值的計算有爭議的地方是附加序列應(yīng)不應(yīng)該計算在內(nèi)， 我覺得有值得商討的地方。 因為從理論上只有最開始的循環(huán)引物的附加序列是不與模板鏈結(jié)合的，而在后來的PCR反應(yīng)中，引物的附加序列是和模板鏈結(jié)合了的。）【 5】引物的3端要與模板嚴格配對，而5端堿基沒有嚴格的限制，只要與模板 DNA 結(jié)合的部分足夠長，其5端堿基可不與模板DNA 配對而呈游離狀態(tài)，這樣， 我們可以在引物的 5 末端加上酶切位點 （引入酶切位點時， 要考慮到進行雙酶切的共用緩沖液，否則給下游工作帶來困難）、啟動子，方便下游操

26、作?！?6】 不要在擴增序列的二級結(jié)構(gòu)區(qū)設(shè)計引物， 以免退火困難。 也要考慮引物設(shè)計處模板的特異性。PCR 引物設(shè)計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板 DNA 序列。因此，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到 PCR 的特異性與成功與否。要設(shè)計引物首先要找到 DNA 序列的保守區(qū)。同時應(yīng)預(yù)測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結(jié)構(gòu)。 如這個區(qū)域單鏈能形成二級結(jié)構(gòu)， 就要避開它。 如這一段不能形成二級結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計引物?，F(xiàn)在可以在這一保守區(qū)域里設(shè)計一對引物。 一般引物長度為 1530 堿基， 擴增片段長度為100600堿基對。讓我們先看看P1 引物。一般引物序列中G C 含量一般

27、為 40%60%。而且四種堿基的分布最好隨機。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則P1 引物設(shè)計的就不合理。應(yīng)重新尋找區(qū)域設(shè)計引物。同時引物之間也不能有互補性，一般一對引物間不應(yīng)多于4 個連續(xù)堿基的互補。引物確定以后，可以對引物進行必要的修飾，例如可以在引物的5端加酶切位點 序列；標記生物素、熒光素、地高辛等，這對擴增的特異性影響不大。但3'端絕對不能進行任何修飾，因為引物的延伸是從3端開始的。這里還需提醒的是 3'端不要終止于密碼子的第 3 位， 因為密碼子第 3 位易發(fā)生簡并， 會影響擴增的特異性與效率。綜上所述我們可以歸納十條PCR 引物的設(shè)計原則： 引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)

28、計并具有特異性。 產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。 引物長度一般在1530堿基之間。G C含量在40%60%問。 堿基要隨機分布。 引物自身不能有連續(xù)4 個堿基的互補。 引物之間不能有連續(xù)4 個堿基的互補。 引物5'端可以修飾。 引物3'端不可修飾。 引物3'端要避開密碼子的第3位。PCR 引物設(shè)計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA 序列。如前述，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到 PCR 的特異性與成功與否。對引物的設(shè)計不可能有一種包羅萬象的規(guī)則確保PCR 的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計。1 .引物的特異性引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連

29、續(xù)8 個互補堿基同源。2 .避開產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)區(qū)某些引物無效的主要原因是引物重復(fù)區(qū) DNA 二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計算機軟件可以預(yù)測估計mRNA 的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（ G0 ）小于58.6lkJ/mol時， 擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用 7-deaza2'-脫氧GTP取彳t dGTP 對擴增的成功是有幫助的。3 .長度寡核苷酸引物長度為1530bp， 一般為2027mer。 引物的有效長度： Ln=2（ G C）（ A T ， Ln 值不能大于38，因為>38 時，最適延伸溫度會超過Taq D

30、NA 聚合酶的最適溫度（74 ）,不能保證產(chǎn)物的特異性。4 .G C含量G C 含量一般為40%60%。其 Tm 值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度， 一般高于 Tm 值 510。若按公式Tm=4(G C) 2(A T)估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為5580C , 其 Tm 值最好接近72以使復(fù)性條件最佳。5 .堿基礎(chǔ)隨機分布引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚喋吟或聚喀呢的存在。尤其3'端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C,因這樣會使引物在G C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。6 .引物自身引物自身不應(yīng)存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾

31、狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補堿基不能大于3bp。7 .引物之間兩引物之間不應(yīng)不互補性，尤應(yīng)避免3'端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一 對引物間不應(yīng)多于 4 個連續(xù)堿基的同源性或互補性。8 .引物的3端引物的延伸是從3'端開始的，不能進行任何修飾。3端也不能有形成任何二級結(jié) 構(gòu)可能，除在特殊的PCR (AS-PCR)反應(yīng)中，引物3'端不能發(fā)生錯配。在標準PCR反應(yīng)體系中，用2U Taq DNA聚合酶和800 mol/L dNTP(四種dNTP 各 200仙 mol/D 以質(zhì)粒(103 拷貝)為模

32、板，按 95C, 25s； 55C, 25s； 72C, 1min的循環(huán)參數(shù)擴增HIV-1 gag基因區(qū)的條件下，引物3端錯配對擴增產(chǎn)物的影 響是有一定規(guī)律的。A : A錯配使產(chǎn)量下降至1/20, A ： G和C ： C錯七下降至 1/1000引物A:模板G與引物G:模板A錯配對PCR影響是等同的。9 .引物的5端引物的5'端限定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被 修飾而不影響擴增的特異性。引物 5'端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒 光、地高辛、 Eu3 等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA 序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。10 .密

33、碼子的簡并如擴增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā) 生簡并，會影響擴增特異性與效率。特殊目的的引物設(shè)計將在有關(guān)章節(jié)討論。 隨著人們對引物的認識， 一些引物的計算機設(shè)計程序也應(yīng)運而生，下面將討論有關(guān)引物計算機設(shè)計方法引物設(shè)計重點考慮因素、設(shè)計技巧及引物設(shè)計軟件推薦urbest發(fā)表于 2007-07-14 16:35我最近合成了幾十對引物， ，在實戰(zhàn)中多多少少有些心得，拿出來給大家分享。我感覺想把引物合成的比較好， 除了前引物和后引物的 Tm 不能相差太大， 我們還要重點考慮以下 因素：1、 GC% GC 含量對于 PCR 反應(yīng)來說 GC 含量在40% 60% ，一般

34、50%左右比較合適；而對于測序引物和雜交探針來說 GC 含量至少應(yīng)為50% 。產(chǎn)物中 GC 含量最好大于引物中的 GC 含量。2、 Degeneracy 多義性當設(shè)計多義引物時應(yīng)盡量減少引物多義性，這樣會帶來更好的特異性，應(yīng)盡量避免 3 末端的多義性，因為這里即使一個堿基的錯配都能阻止引物延伸。3、 3End Stability 3 末端穩(wěn)定性引物穩(wěn)定性影響它的錯配效率，一條理想的引物應(yīng)該有一個穩(wěn)定性較強的 5 末端和相對穩(wěn)定性較弱的 3 末端。如果引物 3 穩(wěn)定性強，有可能在即使5 末端不配對的情況下造成錯配，形成非特異性擴增條帶( secondary bands)。而 3 末端穩(wěn)定性低的引

35、物較好的原因是在引物發(fā)生錯配時，由于3 末端不太穩(wěn)定引物結(jié)合不穩(wěn)定而難以延伸。4、 GC Clamp GC 鉗引物與目的位點的有效結(jié)合需要有穩(wěn)定的 5 末端。這一段有較強穩(wěn)定性的 5 末端稱為GC 鉗。它保證引物與模板的穩(wěn)定結(jié)合。選擇有合適穩(wěn)定性的引物能在確保不產(chǎn)生非特異性條帶的前提下盡量降低退火溫度。5、 Secondary Structures 二級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)是引物設(shè)計中必須考慮的一個重要因素。 二級結(jié)構(gòu)能顯著影響反應(yīng)中能與模板正確結(jié)合的引物數(shù)量， 發(fā)卡結(jié)構(gòu)的存在能限制引物與目的位點的結(jié)合能力， 從而降低擴增效率，形成發(fā)卡環(huán)的引物則不能在PCR 擴增中發(fā)揮作用。6、 Hairpin 發(fā)卡

36、結(jié)構(gòu)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成是由于引物自身的互補堿基分子內(nèi)配對造成引物折疊形成的二級結(jié)構(gòu)，并由于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成是分子內(nèi)的反應(yīng),僅僅需要三個連續(xù)堿基配對就可以形成。發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性可以用自由能衡量。自由能大小取決于堿基配對釋放的能量以及折疊DNA 形成發(fā)卡環(huán)所需要的能量，如果自由能值大于0 則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定從而不會干擾反應(yīng)，如果自由能值小于 0 則該結(jié)構(gòu)可以干擾反應(yīng)。7、 Dimer 二聚體引物之間的配對區(qū)域能形成引物二聚體， 它是相同或不同的兩條引物之間形成的二級結(jié)構(gòu)。 它造成引物二聚體擴增并減少目的擴增產(chǎn)物， 二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向引物之間形成，如果配對區(qū)域在3 末端問題會更為嚴重， 3

37、 末端配對很容易引起引物二聚體擴增。8、 False Priming 錯配如果引物可以結(jié)合除目的位點外的其他區(qū)域， 擴增效率將明顯降低目的產(chǎn)物帶將減少或出現(xiàn)涂布 ( smear) 。 3 末端連續(xù)幾個堿基配對形成錯配的傾向要高于引物上游區(qū)域同樣數(shù)量的堿基配對，在使用引物設(shè)計軟件時，您可以分別設(shè)定確認為錯配的 3 末端或引物全長形 成連續(xù)堿基配對的數(shù)量。順便說一下，如果是新手，剛開始接觸引物設(shè)計，推薦使用 Primer Premier 5.0 ，因為它 界面簡單，易學(xué)易用；如果你想把引物設(shè)計得盡善盡美，公認的首選軟件是Oligo ，其次我認為是 DNAstar 。 Oligo 功能強大，所以使用

38、起來就沒有Primer Premier 5.0 那么簡便。先用Primer Premier 5.0 設(shè)計，然后把設(shè)計好的引物拿到 Oligo 里去檢測這對引物的優(yōu)劣，我想這 對大多數(shù)引物設(shè)計者是一個不錯的選擇！本實驗心得來自丁香園論壇，查看原帖 分享到網(wǎng)友評論補充一：具體說一下引物中 GC 含量問題引物的 GC 含量一般為 40-60% ，以 45-55 為宜，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。有一些模板本身的 GC 含量偏低或偏高， 導(dǎo)致引物的 GC 含量不能在上述范圍內(nèi)，這時應(yīng)盡量使上下游引物的 GC 含量以及 Tm 值保持接近（上下游引物的 GC 含量不能相差太大） ，以有利于退火溫度的選擇。

39、如果 G-C比例超出，則在引物的 5'端增加As或Ts；而如果A-T比例過高，則同樣在5端增加Gs 或 Cs 。但也有認為：原來普遍認為PCR 引物應(yīng)當有50%的 GC/AT 比率的觀點其實是不對的，以人基因組DNA 為模板，用 81%AT 的引物可以產(chǎn)生單一的、專一的、長250bp ，含有70% AT 的產(chǎn)物。完全沒有必要復(fù)雜地去計算產(chǎn)物和引物的解鏈溫度， PCR 引物的 GC/AT 比率應(yīng)當?shù)扔诨蚋哂谒糯蟮哪０宓?GC/AT 比。發(fā)表于2014-12-18您無權(quán)限看這個帖子，您的積分需要大于5 如何獲得積分？發(fā)表于2014-12-18補充二：b關(guān)于自由能問題（如何根據(jù)自由能判斷

40、引物質(zhì)量）/b1、AG值（自由能）反映了引物與模板結(jié)合的強弱程度。一般情況下，物物白U G值最好呈正弦曲線形狀，即5'端和中間A G值較高，而3'端A G值相對較低，且不要超過9 （AG值為負值，這里取絕對值），如此則有利于正確引發(fā)反應(yīng)而可防止錯誤引發(fā)。3的末端雙鏈的A G是02kcal/mol時， PCR 產(chǎn)量幾乎達到百分之百，隨著其絕對值的增加產(chǎn)量逐漸下降，在 6 時只有 40% 、 到 8 時少于 20%、 而 10 時接近于0。 2、 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量一般不要超過4.5，否則容易產(chǎn)生引物二聚體帶而且會降低引物濃度從而導(dǎo)致PCR 正常反應(yīng)不能進行，與二聚體相關(guān)的一個參數(shù)是堿基的分布， 3 端的連續(xù) GGG 或 CCC 會導(dǎo)致錯誤引發(fā)。 二聚體形成 的能值越高越穩(wěn)定， 越不符合要求。 與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能