湖南農業(yè)大學生物化學-02-核酸的結構與功能-03_PDF轉換成word轉換器

1、 第三章核酸的結構與功能 生物化學（第三版）輔導與習題集（王鏡巖生物化學配套輔導）戴余軍 著湖北辭書出版社2010 - 06當當價：¥20.80 第三章核酸的結構與功能第一節(jié)核酸通論第二節(jié)核酸基本構件單位核苷酸第三節(jié) DNA的分子結構第四節(jié) RNA的分子結構第五節(jié)核酸的某些理化性質第六節(jié)核酸研究常用技術 第五節(jié)核酸的某些理化性質一、核酸的水解二、核酸的兩性解離性質三、核酸的紫外吸收（max=260nm）四、核酸的變性、復性、增（減）色效應五、核酸的熔解溫度（Tm） 一、核酸的水解核酸可被酸、堿或酶水解成為各種組分，其水解程度因水解條件而異，水解產物可用層析、電泳等方法分離。堿水解&#

2、216;RNA能被稀堿水解，在水解過程中，隨著磷酸二酯鍵的斷裂，先生成2,3-環(huán)核苷酸中間物，最后生成2-核苷酸和3-核苷酸的混合物。ØDNA由于不存在2-OH，對稀堿有一定抗性酸水解在酸性條件下，磷酸酯鍵比糖苷鍵更穩(wěn)定，其中穩(wěn)定性最差的是嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵。所以，若對核酸進行酸水解，首先生成的是無嘌呤酸(apurinic acid）。 核酸酶是指所有可以水解核酸的酶。Ø依據(jù)底物不同分類DNA酶(deoxyribonuclease, DNase)：專一降解DNA。RNA酶 (ribonuclease, RNase)：專一降解RNAØ依據(jù)切割部位不同。核酸內

3、切酶：分為限制性核酸內切酶和非特異性限制性核酸內切酶。核酸外切酶：5´3´或3´5´核酸外切酶。 RNase實驗室常用的RNase有兩種，其一是牛胰核糖核酸酶(pancreatic ribonuclease)，又稱RNase I或RNaseA，是一種專一性內切酶，水解產物為3'-嘧啶核苷酸，和以3'-嘧啶核苷酸結尾的寡核苷酸。其二是核糖核酸酶T1(ribonuclease T1)，水解產物為3'-鳥嘌呤核苷酸，和以3'-鳥嘌呤核苷酸結尾的寡核苷酸。 DNase實驗室常用的DNase有牛胰脫氧核糖核酸酶(DNase I, p

4、ancreatic deoxyribonuclease)，可以將單鏈或雙鏈DNA水解為平均長度為4個核苷酸的，以5'-磷酸為末端的寡聚核苷酸。牛脾脫氧核糖核酸酶(DNase II, spleendeoxyribonuclease)，可以將單鏈或雙鏈DNA水解為平均長度為6個核苷酸的，以3'-磷酸為末端的寡聚核苷酸。 核酸的一般理化性質1.核酸為兩性電解質，通常表現(xiàn)為酸性。2.DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末，不溶于有機溶劑。3.DNA溶液的粘度極高，而RNA溶液要小得多。4.RNA能在室溫條件下被稀堿水解而DNA對堿穩(wěn)定。5.沉降行為:不同構象的核酸分子的沉降的速率有很

5、大差異，這是超速離心法提取和純化核酸的理論基礎。 二、核酸的酸堿性質磷酸基的解離胞嘧啶的解離 腺嘌呤核苷酸pK2¢ = 3.7核苷含氮環(huán) pK3 = 6.2第二磷酸基pK1¢ = 0.9第一磷酸基酸的解離曲線鳥嘌呤核苷酸pK2¢ = 3.7含氮環(huán)離子pK1¢ = 0.7第一磷酸基pK3¢ = 6.1第二磷酸基烯醇式羥基化程度pK2¢ = 4.3含氮環(huán)胞嘧啶核苷酸pK3 = 6.3第二磷酸基pK1¢ = 0.8第一磷酸基尿嘧啶核苷酸pK1¢ = 1.0pK3¢ = 6.4第一磷酸基 第二磷酸基烯醇式羥基pH

6、 三、核酸分子具有強烈的紫外吸收核酸在波長 260nm處有強烈的吸收，是由堿基的共軛雙鍵所決定的。這一特性常用作核酸的定性和定量分析。 堿基的紫外吸收光譜 紫外吸收的應用ØDNA或RNA的定量A260= 1.0相當于50g/mL雙鏈DNA(dsDNA)40g/mL單鏈DNA (ssDNA or RNA)20g/mL寡核苷酸Ø確定樣品中核酸的純度分別測定蛋白和核酸在260和280的OD值：純的 DNA兩者比值: A260/A280= 1.8純的RNA兩者比值: A260/A280= 2.0 四、核酸的變性、復性變性：在物理、化學因素影響下， DNA堿基對間的氫鍵斷裂，雙螺旋解

7、開，這是一個是躍變過程，伴有A260增加（增色效應）,DNA的功能喪失。復性：在一定條件下，變性DNA 單鏈間堿基重新配對恢復雙螺旋結構，伴有A 260減小（減色效應）,DNA的功能恢復。變性（加熱）復性（緩慢冷卻） DNA解鏈時的紫外吸收變化30.40.3123天然DNA21變性DNA光吸收核苷酸總吸收值0.20.1220 240 260 280波長（nm）Ø增色效應 (hyperchromic effect)： DNA變性時其溶液OD260增高的現(xiàn)象。這是由于在雙螺旋結構中，堿基有規(guī)律的緊密堆積降低了其對紫外光的吸收。 五、DNA的熔解曲線（melting curve）連續(xù)加熱

8、DNA的過程中以溫度相對于 A260值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。解鏈溫度(melting temperature，Tm)解鏈過程中，紫外吸光度的變化達到最大吸收（完全變性）的一半時所對應的溫度。即此時的 50%的DNA雙鏈被打開DNA的Tm值一般為70-85 影響Tm的因素(1) DNA的均一性越高，Tm的溫度范圍越小。(2) G-C含量越高， Tm的值越大，若GC的含量上升1%，則Tm上升0.41。馬默多蒂（Marmur-Doty）關系式：Tm = 69.3 + 0.41(G + C)%，或GC% =（Tm - 69.3）× 2.44(3) 介質的離子強度較高時， Tm的值較大

9、。（中和負電荷，降低排斥力，穩(wěn)定DNA結構）(4) 變性劑如甲酰胺、尿素、甲醛等可破壞氫鍵，妨礙堿基堆積，使Tm下降。 第三章核酸的結構與功能第一節(jié)核酸通論第二節(jié)核酸基本構件單位核苷酸第三節(jié) DNA的分子結構第四節(jié) RNA的分子結構第五節(jié)核酸的某些理化性質第六節(jié)核酸研究常用技術 第六節(jié)核酸研究常用技術一、分子雜交二、PCR三、DNA序列測定 一、核酸分子雜交(hybridization)Ø不同種類的 DNA單鏈分子或 RNA分子放在同一溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對關系，在適宜的條件可以在不同的分子間形成雜交雙鏈(heteroduplex)。Ø這種雜交

10、雙鏈可以在不同的 DNA與DNA之間形成，也可以在DNA和RNA分子間或者RNA與RNA分子間形成。這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交。 分子雜交的應用Ø 研究DNA分子中某一種基因的位置。Ø 鑒定兩種核酸分子間的序列相似性。Ø 檢測某些專一序列在待檢樣品中存在與否。 分子雜交探針：用放射性同位素或熒光標記，或特定的基團(如生物素，地高辛)標記的DNA或RNA片段。原位雜交技術：直接用探針與菌落或組織細胞中的核酸雜交，未改變核酸所在的位置。點雜交：將核酸直接點在膜上，再與核酸雜交。Southern印跡法：將電泳分離后的DNA片段從凝膠轉移到硝酸纖維素膜上，再進行雜交。Nor

11、thern印跡法：將電泳分離后的RNA吸印到硝酸纖維素膜上再進行分子雜交。 Northern/Southern Blot基本流程圖制備總RNA/DNA樣品瓊脂糖凝膠電泳印跡轉移至薄膜與同位素標記的特異性探針雜交放射性自顯影 法可用于檢測特異的序列片 基因芯片發(fā)展歷史Southern & Northern BlotDot BlotMacroarrayMicroarray 基因芯片（Gene Chip）基因芯片,又稱DNA微陣列(DNA microarray），將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地高密度地排列固定于支持物上，制成基因微陣列,樣品（DNA/RNA）通過PCR擴

12、增、體外轉錄等技術摻入熒光標記分子，然后按堿基配對原理進行雜交，再通過熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，并配以計算機系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號作出比較和檢測，從而迅速得出所要的信息?？蓪蛐蛄屑肮δ苓M行大規(guī)模、高通量地研究。 DNA Microarray analysis of gene expressionTreatment / controlNormal / tumor tissueBrain / liver Image of a DNA Microarray 二、聚合酶鏈式反應（PCR）定義： PCR技術又稱聚合酶鏈式反應（polymerase chainreaction)，是通過模擬體內

13、 DNA復制的方式，在體外選擇性地將 DNA某個特殊區(qū)域擴增出來的技術。原理：在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán)的反應過程,每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;擴增了特異區(qū)段的DNA帶。靈敏度高、特異性強、產率高、重復性好、操作簡便、快速 循環(huán)次數(shù)取決于模板DNA的濃度 30次擴增100萬倍 PCRu理論擴增率： 2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)）， 2530循環(huán)，目標DNA可增加10 倍。9u實際擴增率：() ，X為PCR的

14、實際擴增率，n平均約為75%。u由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，擴增產物的增加，逐漸由指數(shù)形式變?yōu)榫€性形式，所以實際上進行 30個循環(huán)后，擴增倍數(shù)一般可達106107。u以“變性、退火、延伸”三部曲為 PCR一輪循環(huán)。 DNA測序技術的歷史第一代DNA測序技術三測序方法的原理第二代DNA測序技術三個測序平臺的工作原理及操作步驟第三代DNA測序技術單分子測序的特點及應用前景自沃森和克里克在1953年建立DNA雙螺旋結構以來，整個測序技術的發(fā)展歷程。 1998 2000 2001 200220042006 200720082009 201020112012 DNA測序技術的誕生和發(fā)展DN

15、A測序技術的誕生（第一代DNA測序技術）v 1977年，英國劍橋醫(yī)學研究會的分子生物學實驗室Frederick Sanger發(fā)明雙脫氧鏈終止法DNA測序技術(Sanger和Coulson)v 1977年，美國哈佛大學生化學家Walter Gilbert發(fā)明DNA化學降解法測序技術(Maxam 和Gilbert,1977)Ø1980年， Sanger和Gilbert因建立DNA測序技術而獲得諾貝爾化學獎（Sanger是第2次獲得諾貝爾化學獎） 1、雙脫氧鏈終止法原理：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4種dNTP存在條件下復制時，在四管反應系統(tǒng)中分別按比例引入4種雙脫氧核苷三磷酸( ddN

16、TP) ，因為雙脫氧核苷沒有3 ´-OH，所以只要雙脫氧核苷摻入鏈的末端,該鏈就停止延長，若鏈端摻入單脫氧核苷,鏈就可以繼續(xù)延長。如此每管反應體系中便合成以各自的雙脫氧堿基為3 ´端的一系列長度不等的核酸片段。反應終止后，分4個泳道進行凝膠電泳,分離長短不一的核酸片段，長度相鄰的片段相差一個堿基。經(jīng)過放射自顯影后,根據(jù)片段3端的雙脫氧核苷，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。 用于終止反應的雙脫氧核苷酸Ø將2 ，3 雙脫氧核苷酸（ddNTP）參入到新合成的DNA鏈中，由于參入的ddNTP缺乏3 羥基，因此不能與下一位核苷酸反應形成磷酸二酯鍵，DNA合成反應將中止。

17、 技術路線與要求A 克隆于質粒中DNA用堿或熱變性制備單鏈模板B M13克隆單鏈DNAC 噬粒克隆DNA將單鏈模板與一小段引物退火D PCR產生單鏈DNA加入DNA多聚酶4種脫氧核苷酸ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP分別加入少量4種雙脫氧核苷酸將4種反應產物分別在4條泳道電泳根據(jù)4個堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列 2.化學降解法美國哈佛大學的Maxam和Gilbert于1977年發(fā)明的，化學降解法主要用于測定短片段DNA的序列。用化學試劑處理末端放射性標記的DNA片段，造成堿基的特異性切割。由此產生的一組具有各種不同長度的DNA鏈的反應混合物，經(jīng)凝膠電泳和放射自顯影后，直接

18、讀出待測DNA片段的核苷酸順序。 化學裂解法測定DNA的核苷酸序列 Ø Maxam-Gilber法所能測定的長度要比Sanger法短一些，它對放射性標記末端 250個核苷酸以內的DNA序列效果最佳。Sanger 法需要單鏈模板和特異寡核苷酸，并需獲得大腸桿菌DNA 聚合酶IKlenow 片段的高質量酶制劑，而Maxam-Gilbert法只需簡單化學試劑。Ø 隨著M13 噬菌體和噬菌粒載體的發(fā)展，也由于現(xiàn)成的合成引物唾手可得及測序反應日臻完善，雙脫氧鏈終止法如今遠比Maxam-Gilbert法應用得廣泛。Ø 然而，化學降解較之鏈終止法具有一個明顯的優(yōu)點：所測序列來自

19、原DNA 分子而不是酶促合成所產生的拷貝。因此，利用Maxam-Gilbert法可對合成的寡核苷酸進行測序，可以分析諸如甲基化等DNA修飾的情況。Ø 由于Sanger法既簡便又快速，因此是現(xiàn)今的最佳選擇方案。事實上，目前大多數(shù)測序策略都是為Sanger法而設計的。 3、熒光自動測序技術熒光自動測序技術基于Sanger原理，用四種不同的熒光混合物分別標記四種反應的產物，用四種反應物混合在一起進行電泳，在激光的激發(fā)下四種帶有不同熒光染料標記物的ddNTP可以在同一反應管種進終止測序反應，并于變性的聚丙烯酰胺凝膠的同一泳道中進行電泳檢測。當帶有某種熒光素標記的DNA片段電泳到激光探頭的檢測

20、范圍時，激光所激發(fā)的熒光信號被探測器接受，經(jīng)計算機分析數(shù)據(jù)，自動排列出DNA序列。 第一代半自動測序示意圖 第一代全自動測序 毛細管電泳測序用毛細管電泳取代聚丙烯凝膠平板電泳，可使DNA的測序速度更為迅速。這種電泳裝置有96個泳道，每次可同時進行96次測序，每輪實驗不到2小時，1天可完成近千次反應。 毛細管電泳測序裝置 第一代測序法的比較方法優(yōu)點缺點雙脫氧末端終止法 化學降解法 熒光自動測序技術操作簡便，結果清晰可靠，一次能確定300500個核苷酸序不需要進行酶促反應，可以分析 自動化程度高，高甲基化等DNA的 效率，精確度增加列，已成為最常用的修飾情況DNA測序方法一次最多只能分花費時間過久

21、，成本 析250個核苷酸，純化量小，不能純化較長的片段較高所用的許多化學試劑有毒 第二代DNA測序技術p二代測序的核心思想是邊合成邊測序，即通過捕捉新合成的末端的標記來確定DNA的序列。p第二代測序技術最顯著的特征是高通量,一次能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測序,使得對一個物種的轉錄組測序或基因組深度測序變得方便易行。p第二代測序技術主要包括羅氏公司的454（GS FLX）測序平臺、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer測序平臺和ABI公司的SOLiD測序平臺。 1、 Roche 454GS FLX454公司可謂新一代測序技術的奠基人。2005年底，454公

22、司推出了革命性的基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)Genome Sequencer 20 System，被Nature雜志以里程碑事件報道，開創(chuàng)了邊合成邊測序（sequencing-by-synthesis）的先河。后來，他們又推出了全新的GS FLX系列試劑和軟件的補充，讓GS FLX的通量一下子提高了5倍，準確性、讀長也進一步提升。 Roche 454測序原理原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的作用下，將每一個dNTP的聚合與一次化學發(fā)光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測化學發(fā)光信號的有無和強度，達到實時檢測DNA序列的目的。 乳液PCR（emRCR）每個獨特的片段在

23、自己的微反應器里進行獨立的擴增，而沒有其他的競爭性或者污染性序列的影響。整個片段文庫的擴增平行進行。對于每一個片段而言，擴增后產生了幾百萬個相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，攜帶擴增片段的磁珠進入進入反應板。 一個磁珠一條讀長Ø放置在單獨的試劑瓶里的堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進入反應板，每次只進入一個堿基Ø如果發(fā)生堿基配對，就會釋放一個焦磷酸。Ø焦磷酸在ATP硫酸化酶和螢光素酶的作用下，將螢光素氧化成氧化螢光素，同時釋放出光信號，并被高靈敏度CCD捕獲到。 GS FLX測序技術的優(yōu)點GS FLX系統(tǒng)的測序也是一種依靠生物發(fā)光進行DNA序列分析的新技術

24、。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號釋放偶聯(lián)起來。通過檢測熒光信號釋放的有無和強度，就可以達到實時測定DNA序列的目的。此技術不需要熒光標記的引物或核酸探針，也不需要進行電泳；特點：分析結果快速、準確、靈敏度高和自動化。 2.Illumina -Solexa Genome AnalyzerSolexa系統(tǒng)應用了邊合成邊測序（Sequencing BySynthesis）的原理。加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP。這些核苷酸是“可逆終止子”，因為3羥基末端帶有可化學切割的部分，它只容許每個循環(huán)摻入單個堿基。

25、此時，用激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第一輪反應所聚合上去的核苷酸種類。之后，將這些基團化學切割，恢復3'端粘性，繼續(xù)聚合第二個核苷酸。這樣，統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結果，就可以得知每個模板DNA片段的序列。 Solexa測序技術的特點通量高：目前一臺機器在兩周內最高可產出360G的數(shù)據(jù);準確率高：高于98.5% ，同時也有效地解決了多聚重復序列的讀取問題;成本低：低于傳統(tǒng)Sanger測序技術的成本; 3. ABI SOLiD測序技術SOLiD的獨特之處在于以四色熒光標記寡核苷酸的連續(xù)連接合成為基礎，取代了傳統(tǒng)的聚合酶連接反應，可對單拷貝DNA片段進行大規(guī)模擴增和高通量并行測序。就通量而言，SOLiD 3系統(tǒng)是革命性的，目前SOLiD 3單次運行可產生50GB的序列數(shù)據(jù)，相當于17倍人類基因組覆蓋度。而其無以倫比的準確性、系統(tǒng)可靠性和可擴展性更讓它從其他新一代測序平臺中脫穎而出。 三大測序平臺的技術特點和差異大約讀長(堿基數(shù))平臺名稱檢測方法公司測序方法優(yōu)點相對局限性樣品制備較難；難于在第二代中最高讀長；處理重復和同種堿基比第一代的測序通量 多聚區(qū)域；試劑沖洗基因組羅氏 測序儀 焦磷酸測230-400光學/454 FLX系統(tǒng)序法大帶來錯誤累積；儀器昂貴HiSeq2illumina可逆鏈終000/mi 止物和合Seq 成測序法儀器昂貴；用于數(shù)據(jù)刪節(jié)和分