莪術(shù)油注射液對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞脹亡及Bcl2表達(dá)的影響

1、莪術(shù)油注射液對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞脹亡及Bcl-2表達(dá)的影響作者：楊美春,方剛,李林,覃振林,鐘振國(guó),楊思源,湯紅麗【摘要】 目的 觀察莪術(shù)油注射液對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞脹亡指數(shù)及Bcl-2表達(dá)的影響,探討莪術(shù)油注射液致人卵巢癌SKOV3細(xì)胞脹亡的機(jī)制。方法 以不同濃度莪術(shù)油注射液作用人卵巢癌SKOV3細(xì)胞后,通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核變化、透射電鏡計(jì)算細(xì)胞脹亡指數(shù)、瓊脂糖凝膠電泳觀察細(xì)胞DNA斷裂情況、免疫組化觀察細(xì)胞Bcl-2基因的表達(dá)。結(jié)果 人卵巢癌SKOV3細(xì)胞經(jīng)莪術(shù)油注射液作用48 h后,熒光顯微鏡觀察到脹亡細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞腫脹,體積增大,胞膜面積縮小,核染色質(zhì)分散擴(kuò)大；細(xì)胞脹亡指數(shù)隨

2、濃度的增加而增大,呈量效關(guān)系；電泳觀察DNA呈彌漫型；Bcl-2基因表達(dá)下調(diào)。結(jié)論 莪術(shù)油注射液可使人卵巢癌SKOV3細(xì)胞隨濃度的增加而脹亡指數(shù)增大,并可下調(diào)Bcl-2基因表達(dá),提示下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)可能是莪術(shù)油注射液致SKOV3細(xì)胞脹亡的作用機(jī)制之一。 【關(guān)鍵詞】 莪術(shù)油注射液；人卵巢癌SKOV3細(xì)胞；脹亡指數(shù)；Bcl-2 Abstract：Objective To discuss the impact of zedoary turmerie oil (ZTO) injection over oncosis index and Bcl-2 expression of human ovar

3、ian cancer SKOV3 cell. Methods After ZTO injection acted on human ovarian cancer SKOV3 cells, the changes in the nucleus were observed by fluorescence microscope, oncosis index was counted by projection electron microscope, the situation of cell DNA breakage was observed by agarose gel electrophores

4、is, and cell Bcl-2 gene expression was observed by immunohistochemical method. Results After treated by ZTO injection for 48 hours, human ovarian cancer SKOV3 cells shows that oncosis cell was swelling in fluorescence microscope, the volume increased, the membrane area narrowed, the nuclear chromati

5、n expansed. The oncosis index increased with dose-effect relationship, DNA electrophoresis showed diffuse type and Bcl-2 gene expression was down-regulated. Conclusion ZTO injection can increase oncosis index of human ovarian cancer SKOV3 cell with the concentration, and lower Bcl-2 gene expression,

6、 which may be one of the mechanisms of ZTO injection caused oncosis of SKOV3 cell.2 / 12 Key words：zedoary tumerie oil injection；human ovarian cancer SKOV3 cell；oncosis index；Bcl-2 我們?cè)谇捌诘膶?shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn),莪術(shù)油注射液對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞有明顯的抑制作用,并且能導(dǎo)致SKOV3細(xì)胞出現(xiàn)脹亡現(xiàn)象1-2。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化、計(jì)算細(xì)胞脹亡指數(shù)、細(xì)胞DNA斷裂情況、檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)來(lái)進(jìn)一步探討其作用

7、機(jī)制。1 實(shí)驗(yàn)材料人卵巢癌SKOV3細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所,廣西腫瘤防治研究所臨床中心實(shí)驗(yàn)室傳代保存。細(xì)胞用含有10%滅活小牛血清、100 U/mL青霉素、100 g/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液于37 、5%CO2條件下培養(yǎng)。熒光顯微鏡為美國(guó)產(chǎn),電泳儀為日本產(chǎn),H-500日立透射電鏡,Bcl-2 SP法免疫組化的試劑盒(福州邁新公司),RPMI-1640和小牛血清為Gibco公司產(chǎn)品,其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。莪術(shù)油注射液購(gòu)自黑龍江瑞格制藥有限公司(批號(hào)051101,國(guó)藥準(zhǔn)字：H20023314)。2 實(shí)驗(yàn)方法2.1 熒光顯微鏡觀察 選擇濃度為31.25、62.5、125 g

8、/mL的莪術(shù)油注射液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)1。用6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞,預(yù)先將小蓋玻片放置于培養(yǎng)板底部,調(diào)整細(xì)胞密度至1.0×104個(gè)/mL,每孔2 mL。置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,更換培養(yǎng)液,加入藥物。實(shí)驗(yàn)組加入終濃度分別為31.25、62.5、125 g/mL的莪術(shù)油注射液,同時(shí)以RPMI-1640培養(yǎng)液作為空白對(duì)照組,48 h后取出蓋玻片,PBS洗滌,加入吖啶橙儲(chǔ)存液(10 mg/L)5 L,在氯化鈣介質(zhì)中染色,熒光顯微鏡觀察,攝片。2.2 透射電鏡觀察計(jì)數(shù)脹亡細(xì)胞指數(shù) 參照文獻(xiàn)3方法并改進(jìn)。選擇濃度為31.25、62.5、125 g/mL的莪術(shù)油注射液進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每個(gè)濃度制作10個(gè)標(biāo)本

9、。按照上述濃度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,作用48 h后,收集細(xì)胞,清洗后1%鋨酸固定,0.1%PBS清洗,常規(guī)脫水,浸透,環(huán)氧樹(shù)脂包埋,切成超薄切片,透射電子顯微鏡觀察計(jì)數(shù)脹亡細(xì)胞,并計(jì)算細(xì)胞脹亡指數(shù)。2.3 瓊脂糖凝膠電泳細(xì)胞DNA斷裂情況 經(jīng)31.25、55.16、62.5、125 g/mL濃度的莪術(shù)油注射液作用48 h后,收集細(xì)胞,用PBS洗滌數(shù)次,加入0.5 mL細(xì)胞裂解液, 10 L蛋白酶K(20 g/L)置37 水浴中過(guò)夜,用等體積的飽和酚萃取,10 000 r/min離心,取上層,加入等體積的氯仿-異戊醇(241)除蛋白,10 000 r/min離心10 min,取上清液,加入3倍體積

10、的無(wú)水乙醇、1/10體積的的醋酸鈉(3 mol/L),置-20 20 min,取出離心,沉淀用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇洗滌2次,空氣干燥。加入200 L TE溶解,RNase酶2 L(10 g/L)反應(yīng)30 min(37 )。取上述樣品20 L,在2%瓊脂糖凝膠電泳,75 V,1.5 h,攝像。2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Bcl-2基因的表達(dá) 參考文獻(xiàn)4方法,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3,調(diào)整細(xì)胞濃度1.0×104個(gè)細(xì)胞/mL,接種至內(nèi)鋪玻片的12孔培養(yǎng)板內(nèi),置于37 、5% CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后,加入終濃度為55.16 g/mL (莪術(shù)油注射液作用SKOV3 48 h后其IC5055

11、.16 g/mL2)濃度的藥物,并設(shè)對(duì)照組(僅加培養(yǎng)基),每孔液體體積為2 mL。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,取出玻片,PBS洗5 min×3次,95%酒精固定20 min,嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。結(jié)果判斷：排除爬片中間細(xì)胞,10×10低倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)細(xì)胞分布均勻的視野,10×20中倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞視野。按著色強(qiáng)弱分為4個(gè)等級(jí)：無(wú)著色0分,淡黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分(抗體陽(yáng)性部位均在胞漿)。按公式HSCOREPi(i+1)(i0,1,2,3；Pi表示評(píng)分為i的比例)計(jì)算HSCORE得分5。該評(píng)分方法考慮到了單個(gè)細(xì)胞是否陽(yáng)性

12、及其強(qiáng)弱,更具體真實(shí)地反映細(xì)胞的蛋白表達(dá)情況。3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,所有數(shù)據(jù)以x±s表示,細(xì)胞脹亡指數(shù)行單因素方差分析,Bcl-2的表達(dá)比較行t檢驗(yàn)。4 結(jié)果4.1 熒光顯微鏡觀察結(jié)果 吖啶橙染色后,熒光顯微鏡觀察,空白對(duì)照組SKOV3細(xì)胞呈均勻熒光染色,而細(xì)胞經(jīng)不同濃度莪術(shù)油注射液的作用48 h后,主要變化為細(xì)胞腫脹,體積增大,胞膜面積縮小,核染色質(zhì)分散擴(kuò)大,尤其在125 g/mL濃度可見(jiàn)明顯的腫脹細(xì)胞,胞漿染色極不明顯,未發(fā)現(xiàn)明顯的凋亡細(xì)胞(即細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)致密濃染顆粒狀熒光)。4.2 脹亡指數(shù)(見(jiàn)表1)表1 SKOV3細(xì)胞脹亡指數(shù)比較(略

13、)注：與空白組比較,*P0.05,*P0.01；與莪術(shù)油注射液中劑量組比較,#P0.01；與莪術(shù)油注射液低劑量組比較,P0.014.3 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Bcl-2基因表達(dá)結(jié)果 經(jīng)免疫組化染色后的切片,陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色染色。細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的HSCORE得分見(jiàn)表2。表2 SKOV3細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的HSCORE得分比較(略)注：與空白組比較,*P0.014.4 DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 經(jīng)不同濃度莪術(shù)油注射液處理后, SKOV3細(xì)胞DNA條帶均呈彌漫型,瓊脂糖電泳未出現(xiàn)典型的凋亡梯度狀條帶。見(jiàn)圖1。5 討論 細(xì)胞脹亡是由多基因調(diào)控的被動(dòng)死亡的過(guò)程,在形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特征上明顯不同于

14、細(xì)胞凋亡。目前研究表明,異常細(xì)胞脹亡與腫瘤發(fā)生發(fā)展有極密切的關(guān)系,可通過(guò)導(dǎo)致細(xì)胞脹亡來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用6。目前標(biāo)志細(xì)胞脹亡的指標(biāo)很多,除了透射電鏡觀察以外,瓊脂糖凝膠電泳也可證明脹亡的存在。由于CAD(caspase activated DNase)7的作用,脹亡細(xì)胞DNA內(nèi)的核小體為彌漫性隨機(jī)碎片,經(jīng)電泳后呈隨機(jī)性電泳條帶,區(qū)別于凋亡細(xì)胞的階梯狀條帶。在細(xì)胞脹亡的調(diào)節(jié)中,Bcl-2發(fā)揮了作用,有研究發(fā)現(xiàn)脹亡細(xì)胞中的Bcl-2基因表達(dá)常下調(diào)8。 本課題主要研究莪術(shù)油注射液對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞脹亡指數(shù)、Bal-2基因表達(dá)等的影響。按照現(xiàn)行常用的透射電鏡計(jì)數(shù)脹亡細(xì)胞,多參照Hein S等2提出的

15、要求底數(shù)為1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞,但是本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)所收集的每份腫瘤細(xì)胞制作成超薄切片后觀察計(jì)數(shù),每張切片一般不超過(guò)500個(gè)細(xì)胞。因此,本實(shí)驗(yàn)每個(gè)標(biāo)本只計(jì)算1個(gè)脹亡指數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,莪術(shù)油注射液作用SKOV3細(xì)胞后,其細(xì)胞脹亡指數(shù)隨濃度的增加而增大,呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系(P0.01)。熒光顯微鏡觀察到脹亡細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞腫脹,體積增大,胞膜面積縮小,核染色質(zhì)分散擴(kuò)大；電泳觀察DNA呈彌漫型條帶；免疫組化提示,莪術(shù)油注射液導(dǎo)致人卵巢癌SKOV3細(xì)胞脹亡與下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)有關(guān)。 總之,莪術(shù)油注射液致人卵巢癌SKOV3細(xì)胞脹亡隨濃度的增加脹亡指數(shù)增大,并且可下調(diào)Bcl-2基因表達(dá),提示下調(diào)Bcl-2

16、基因表達(dá)是莪術(shù)油注射液致SKOV3細(xì)胞脹亡的作用機(jī)制之一。 致謝：對(duì)廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心黎丹戎教授、廣西中醫(yī)學(xué)院病理教研室王進(jìn)聲老師等在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的指導(dǎo)和大力協(xié)助深表感謝。【參考文獻(xiàn)】 1 楊美春,方 剛,張奕梅,等.莪術(shù)油注射液致人卵巢癌SKOV3細(xì)胞脹亡形態(tài)變化的研究J.實(shí)用藥物與臨床,2009,12(1)：13.2 楊美春,方 剛,鐘振國(guó),等.莪術(shù)油注射液對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響J.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2009,20(3)：603604.3 Hein S, Amon E, Kostin S, et a1. Progression from compensated hypert

17、rophy to failure in the pressure overloaded human heart：structural deterioration and compensatory mechanismsJ. Circulation, 2003,107(7)：984991.4 陳小芬,湯為學(xué),李龍江.姜黃素對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的抗增殖作用J.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2005,30(2)：256259.5 Harrington DJ, Lessey BA, Rai V, et al. Tenascin is differentially expressed in endometrium and endometriosisJ. J Pathol,1999, 187(2)：242248.6 曹獻(xiàn)英,張 珠,張 然,等.磷灰石納米粒子體外致肝癌細(xì)胞的脹亡J.中國(guó)腫瘤,2003,12(6)：248350.7 Zhao K, Zhao GM, Wu D, et a1. Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling,