體外細(xì)胞試驗(yàn)方法

1、細(xì)胞株在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中保持10% FBS從 Addgene(質(zhì)粒)購買 HA-FLAG-UCHL3#22564,然后再克隆到 pGEX-4T-2載體(Clontech)中。UCHL3C94A 和S75A突變體由位點(diǎn)定向 突變層積產(chǎn)生)?？箄chl3抗體購自 ProteinTech公司(12384 - 1 - ap)?？?ub (P4D1)、抗 rpa32 (9H8)、抗 brca1 (D9)抗體購自 Santa CruzBiotechnology 。 抗 rad51 (N1C2)是從 Gen eTex 購買的。反Y H2AX(05 - 636),anti-BRCA2(OP95 和 anti-M

2、DC1(05 - 1572)從微孔被購買。Anti-BRCA2推上a303國道-435 a)和anti- Y H2AX 架 a300 型(-081 a)從 Bethyl 購買實(shí)驗(yàn)室?？?3bp1 (NB100-304)購自 NovusBiologicals 。 Anti-Flag(m2)、anti-HA anti- 3 -actin 抗體購買的Co反磷(血清/thr) atm/atr襯底抗體(2851 )是從細(xì)胞信號(hào)技術(shù)中購買的。CRISPR / Cas9 敲 除(sgRNAs 使用：sgUCHL3-1(5' -GCCGCTGGAGGCCAATCCCGAGG-3 )和 sgUCHL3-

3、2(5 -GCCCCGAAGCGCGCCCACCTCGG-3 ) 。 gRNA序列被克隆到載體中。LentiCRISPR-V2-puro 細(xì)胞被慢病毒感染sgRNA-puro隨后與2 P g /毫升喋吟霉素廣泛的選擇)和單一的克隆是通過連續(xù)稀釋和放大。通過免疫印跡鑒定克隆抗uchl3抗體，并通過 DNA測序驗(yàn)證。重組蛋白表達(dá)和下拉試驗(yàn)。構(gòu)建表達(dá)His-RAD51和GSTUCHL3蛋白的質(zhì)粒，構(gòu)建 RAD51和UCHL3的編碼序列被亞克隆為pET-32a和pGEX-4T-2為了產(chǎn)生重組蛋白，每個(gè)表達(dá)結(jié)構(gòu)都轉(zhuǎn)化為大腸桿菌BL21(DE3)?？傊?，在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌在 37° C到1.2

4、QD600)和冷卻30分鐘在冰上。然后細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng) 15 h 在 18° C 添加 0.8 毫米 isopropyl-b-D-hiogalactopyranoside 之后(IPTG)o 細(xì)胞然后 用超聲波提取和裂解。細(xì)胞溶解產(chǎn)物用16000g離心30min，得到的上清液與他的Mag Sepharose Ni (GE Healthcare) 孵育，純化 His-rad51蛋白和 GSH珠(Promega),純化 分別是 GST和GST- uchl3蛋白。體外GST-UCHL顯試驗(yàn),50 口重組GST和GST-UCHL3蛋白質(zhì)綁定到谷胱甘肽珠子被5% BSA在4 C 2 h其次是孵化與

5、50 P g His-UCHL額外2 h在4° G然后用不同鹽濃度的NETN緩沖液沖洗5次。結(jié)合蛋白被篩選了1X SDSPAGE g沖與加熱10分鐘在95° G用單克隆抗his抗體檢測 His-RAD51 ,用 Coomassie blue 染色 GST-UCHL3體內(nèi)變性去泛素化實(shí)驗(yàn)和體外脫泛素化實(shí)驗(yàn)對(duì)于體內(nèi)去泛素化實(shí)驗(yàn)，控制 U2OS細(xì)胞，UCHL3敲除U2OS細(xì)胞，或 UCHL3敲除U2OS細(xì)胞 穩(wěn)定表達(dá) HA-UCHL3野生型和突變 Cys95阿拉巴馬州(CA突變)在120年被細(xì)胞溶解 入L 62.5毫 米Tris-HCl(pH 值6.8),2% SDS、10%甘油

6、,20毫米NEM,1毫米碘乙酰胺；煮15分鐘；用含有蛋白 酶抑制劑的NETN緩沖720mm NEM和1mm碘乙酰胺進(jìn)行測定 10次;然后離心分離細(xì)胞碎片。細(xì) 胞提取物的免疫沉淀與指示抗體和涂抹抗ub抗體。為了制備大量泛素化蛋白作為體外脫泛素實(shí)驗(yàn)的底物，HEK293T細(xì)胞與Myc-RAD51和His-Ubexpression載體一起轉(zhuǎn)染。在變性條件下，用他的珠子從細(xì)胞提 取物中純化泛素蛋白。接下來，用 Ub-RAD51蛋白從細(xì)胞提取物中純化抗myc -瓊脂糖 顆粒在裂解緩沖液(50mm Tris-HCl pH) 中 7.8, 137 毫米 NaCl, 10 毫米 NaF, 1 毫 米 EDTA,

7、 1% Triton X-1000.2% 薩 科齊，1mm DTT, 10% 甘油，新鮮蛋白酶抑制劑)。重組 GST-UCHL3和UCHL3 CA 在BL21細(xì)胞中表達(dá)，按照標(biāo)準(zhǔn)方案純化。deubiquitination測定體外,ubiquitinated蛋白質(zhì)是孵化與重組 UCHL3eubiquitination 緩沖區(qū)(50毫米 Tris-HCl pH 值8.0,50 mM 氯化鈉，EDTA 1毫米,10毫米德勤,5% 甘 油）4 h 30 C-PR ±芯片 通過轉(zhuǎn)染I-SceI表達(dá)質(zhì)粒，在 U2OS DR-GFP細(xì)胞中誘導(dǎo)單個(gè) DSB 。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)， 細(xì)胞 在室溫下用1%甲

8、醛固定10分鐘，將蛋白質(zhì)與 DNA交聯(lián)。加入甘氨酸（0.125 M） 5分鐘，停止交 聯(lián)。細(xì)胞被收獲，顆粒在細(xì)胞裂解緩沖 resuspended（5毫米管道（KOH）在pH值8.0,85毫米氯化 鉀,0.5% NP-40）亮抑酶肽1 fig /毫升,1 fig /毫升抑肽酶,1毫米PMSF 。核在2000克的離心作用下， 5分鐘內(nèi)被離心分離，然后在核溶解緩沖中重新懸?。?0 mM Tris在pH.1 , 10毫米EDTA ,1%SDS , 1 g/mL , 1 g/mL aprotinin1毫米PMSF ）,并將染色質(zhì)切成平均大小為0.6 kb的染色質(zhì)。用三文魚精子 DNA/蛋 白-瓊脂糖漿液

9、預(yù)先清除裂解物。每個(gè)上清液的10%作為輸入控制，并通過交聯(lián)反轉(zhuǎn)步驟進(jìn)行處理。其余的上層清液與5 ig孵化表示抗體在一夜之間在4 C O珠被洗了四次：一次在高鹽緩沖（50毫米Tris-HCl pH 值8.0,500毫米氯化鈉,0.1% SDS、脫氧膽酸鹽 0.5%,1% NP-40,1毫米EDTA）,在氯化鋰緩沖區(qū) （50毫米 Tris-HCl pH 值8.0,250毫米氯化鋰,NP-40 1%,0.5% 脫氧膽酸鹽,1毫米 EDTA）,和兩次 TE緩沖（10毫米 Tris-HCl pH 值8.0,1毫米 EDTA,pH 值8.0）。然后在洗脫緩沖液（1% SDS, 0.1 M NaHCO3）中

10、重新懸浮，在室溫下旋轉(zhuǎn)20分鐘。洗脫樣品孵育 0.2M氯化鈉一夜之間在 65 到反向交聯(lián)。樣本孵化與核糖核酸酶為 30分鐘37 C其次是蛋白酶 K 1 h在37 ° C。然后使用PCR清理試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行純化，并用于定量PCR分析。芯片的PCR引物,-220個(gè)堿基對(duì)遠(yuǎn)離l-Scel削減網(wǎng)站如下：向前，5 -GAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3'和反向5 -CCGTAGGTCAGGGTGGTCAC-3 '。HR分析我們使用來自 Maria Jasin 博士（紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心）的U2OS DR-GFP細(xì)胞，通過 CRISPR系統(tǒng)產(chǎn)生控制或 UCHL3敲除 U2OS DR-GFP 細(xì)胞系。將ISceI表達(dá)載體 （pCBA-I-SceI）轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。在I-SceI轉(zhuǎn)染后2 d采集細(xì)胞，并使用流式細(xì)胞術(shù)檢測I-SceI消化誘導(dǎo)的重組。采用pEGFP-C1平行轉(zhuǎn)染法對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行歸一化處理。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù) 對(duì)于細(xì)胞存活試驗(yàn)和 HR試驗(yàn)，數(shù)據(jù)提出了均值 土 SEM的三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于焦點(diǎn)形成 分析