自動生化分析儀的分析參數(shù)設置

1、自動生化分析儀的分析參數(shù)設置核心提示:自動生化分析儀是一種把生化分析中的取樣、加試劑、去干擾物、混合、恒溫反應、 自動監(jiān)測、數(shù)據(jù)處理以及實驗后清洗等步驟進行自動化操作的儀器，它完全模仿并代替了手工操作，目前已經(jīng)成為醫(yī)療機構進行臨床診斷所必可不少的儀器之一。它的應用大大提高了生化自動生化分析儀是一種把生化分析中的取樣、加試劑、去干擾物、混合、恒溫反應、自動監(jiān)測、 數(shù)據(jù)處理以及實驗后清洗等步驟進行自動化操作的儀器，它完全模仿并代替了手工操作， 目前已經(jīng)成為醫(yī)療機構進行臨床診斷所必可不少的儀器之一。它的應用大大提高了生化檢驗的準確性、精密度和工作效率，適應了臨床醫(yī)學發(fā)展對檢驗醫(yī)學的要求，然而這一切不

2、僅需要生化分析儀的技術基礎，也需要儀器內(nèi)每個項目都有一組最優(yōu)化的分析參數(shù)。并且目前大多數(shù)生化分析儀為開放式，封閉式的儀器一般也會另外留一些檢測項目的空白通道由用戶自己設定分析參數(shù)，因此我們有必要了解生化分析儀各個分析參數(shù)的基本含義以及設置方法。1. 試驗名稱常以項目的英文縮寫來設置，如總蛋白設置為TP ，白蛋白設置為ALB等。2 .方法類型生化分析儀常用的方法有終點法、連續(xù)監(jiān)測法、比濁法等，根據(jù)被檢物質的檢測原理等選擇其中一種分析方法。2.1 終點法又稱為平衡法，是基于反應達到平衡時反應產(chǎn)物的吸收光譜特征及其對光吸收強度的大小對物質進行定量分析的一類方法，有一點終點法和兩點終點法兩類。一點終點

3、法的特點是使用一種或兩種試劑，當待測物與試劑反應達到終點時，測定混合溶液的吸光度來計算待測物的濃度，該法常用的有總蛋白雙縮脲法、白蛋白溴甲酚綠法、葡萄糖氧化酶法等， 手工操作的大多數(shù)方法都是一點終點法。兩點終點法也稱固定時間法，如果是單試劑分析， 當測定波長同干擾物質的吸收光譜有重疊時，通過選用兩點終點法可消除樣品空白引起的干擾，其分析過程是在樣品與試劑混合后經(jīng)過一段延滯期讀取一個點A1 ，一定時間后再讀取A2,然后比較標準和測定的A A （AA=A2-A1 ）值，求得待測物的濃度。肌酊苦味酸法就是一個典型的單試劑兩點法的例子。如果是雙試劑分析，選用二點終點分析法除了可消除樣品空白引起的干擾外

4、，還可消除內(nèi)源性干擾物質的干擾，其分析過程是加入試劑1后讀取 A1 ，加入試劑2 后讀取 A2 ， A1 相當于讀出樣品空白值，A2 才是實際呈色反應，然后比較標準和測定的 A A （AA=A2-A1 ）值，求得待測物的濃度。為了提高終點法檢測的準確性， 選擇該法時應設置終點法零點讀數(shù)、樣品空白等兩個分析參數(shù)，前者是在反應前即開始讀數(shù)， 可以扣除反應前試劑和樣品混合液的空白讀數(shù)；后者是樣品加空白試劑所得到的吸光度，反應需要占用一個比色杯。 2.2連續(xù)監(jiān)測法又稱動態(tài)分析法、速率法等，基本原理是在酶促反應的最適條件下，用物理、化學或酶促反應的分析方法，在反應速度恒定期（零級反應期）內(nèi)連續(xù)觀察和記錄

5、一定反應時間內(nèi)底物或產(chǎn)物量的變化，以單位時間酶反應初速度計算出酶活力的大小和代謝物的濃度。具體方法有兩點速率法和多點速率法：兩點速率法是通過觀察在零級反應期內(nèi)兩個時間點的吸光度，用兩個點的吸光度的差值（ AA）除以時間（分），計算出每分鐘的吸 光度變化值；多點速率法是在零級反應期內(nèi)每隔一定時間（2-30S）進行一次監(jiān)測，連續(xù)監(jiān)測多次，求出單位時間內(nèi)的反應速度，這種方法又可分為最小二乘法、多點 8法、回歸法、帶 速率時間法等。該法具有明顯的優(yōu)點就是大大提高了分析速度和準確性，主要適用于酶活性及其代謝產(chǎn)物的測定。在連續(xù)監(jiān)測法過程中，即使不加樣品，試劑中的底物也會自動降解得到一個結果，因此應設置試劑

6、空白速率，不同批號試劑的試劑空白速率不一樣，其值為以水 代樣品測得的項目結果，樣品測定結果應扣除試劑空白速率的數(shù)值。2.3 比濁法 自動生化分析儀一般只能做透射免疫比濁分析，當光線通過一定體積的含免疫復合物的溶液時，由于溶液中存在的抗原-抗體復合物粒子對光線的反射和吸收，引起透射光的減少，測定的光通量和抗原抗體復合物的量成反比。它常用于終點法測定，目前主要用于血清特種蛋白的檢測，如載脂蛋白、微量蛋白、急性時相反應蛋白、免疫球蛋白以及某些藥物監(jiān)測等。但是如果樣品中待測抗原濃度過高，抗原與抗體形成的免疫復合物分子將會變小，而且易發(fā)生解離，使?jié)岫确炊陆?，因此免疫比濁分析過程中必須設置前區(qū)檢查，比較

7、分析過程中后兩個讀數(shù)點的差別，如果后一點比前一點的吸光度低，則表示抗原已過剩，應將樣品稀釋后重測。3 .反應溫度自動生化分析儀通過溫度控制系統(tǒng)保持溫度恒定，以保證反應的正常進行，其保持恒溫的方式有三種：干式恒溫器加熱、水浴式循環(huán)加熱、恒溫器循環(huán)間接加熱。恒溫控制器可以對25、30、37三種溫度進行恒溫，根據(jù)需要可以任意選擇，半自動生化分析儀恒溫器屬于這種。全自動生化分析儀的溫度控制器一般只能控制37一種溫度，少數(shù)也可以控制30和37兩種溫度。4 .反應波長當測定體系中只有一種組分或混合溶液中待測組分的吸收峰與其他共存物質的吸收波長無重疊時，可選用單波長，如果待測物質有幾個吸收峰，可選用吸光度最

8、大的一個波長，或者選擇在吸收峰處吸光度隨波長變化較小的某個波長。當被檢溶液混濁或存在較多的干擾物質時，測定過程中會出現(xiàn)光散射和非特異性光吸收，從而影響測定結果的準確性， 此時可用雙波長甚至多波長測定，以提高測定結果的準確性，而在實際應用中選擇輔助波長主要用于消除脂血、溶血、黃疸的干擾。由于脂質、血紅蛋白、膽紅素在較寬的波長范圍內(nèi)有較強的光吸收，常常同測定波長有重疊，此時測得的吸光度包含待測物質的吸光度和干擾物質的吸光度，因此必須選用合適的輔助波長來消除干擾物質的吸光度。輔助波長的設置原則是根據(jù)測定波長選擇輔助波長，要求干擾物質在測定波長同輔助波長有相同的吸光度。 5.反應方向有正向反應和負向反

9、應兩種，反應過程中吸光度增加為正向反應，吸光度下降為負向反應。6 .樣品量與試劑量樣品與試劑量的確定一般按照試劑說明書上的比例，并結合儀器的特性進行設置，亦可根據(jù)手工法按比例縮減或重新設計，但要考慮到檢測靈敏度、線性范圍， 盡可能將樣品稀釋倍數(shù)大些，以降低樣品中其他成分的影響。在樣品與試劑量的設置過程中主要應注意以下幾個方面：稀釋水量，添加樣品稀釋水的是為了洗出粘附在采樣針內(nèi)壁上的微量血清，減少加樣誤差，添加試劑稀釋水是為了避免試劑間的交叉污染，兩種稀釋水的量應在復溶試劑時按比例扣除。如果采用液體試劑盒時因不再用水，無法扣除稀釋水量，所以兩種稀釋水應盡量減少，以免試劑被過量稀釋。最小樣品量，即

10、分析儀進樣針能在規(guī)定的誤差范圍內(nèi)吸取的最小樣品量，隨著技術的不斷改進，儀器的最小樣品量逐漸減小，目前有少至1.6 “的。在樣品含高濃度代謝產(chǎn)物或高活性酶濃度的情況下往往需采用分析儀的 最小樣品量作為減量參數(shù)，從而使儀器的檢測范圍上限得以擴大?？偡磻萘?，在不同的分析儀有一個不同的規(guī)定范圍，在設置的時候樣品量和試劑量之和不能超過這一范圍。該值受儀器的光路系統(tǒng)所影響，直射式光路由于光束較寬，難于減少所測試反應液體積，集束式光路則是通過一個透鏡使光束變窄，可檢測低至180“的反應液混合體，近年來又出現(xiàn)了點光源技術，它的光束更小，照射到樣品杯時僅為一個點，可使反應液的量降至120”。試劑量/樣品量比值

11、，不要為節(jié)省試劑而過分地減少試劑用量，因為在終點比色法中，縮小試劑量/樣品量比值會降低線性范圍，遇高濃度樣本會因試劑量不足而使結果偏低。7 .分析時間分析時間包括孵育時間、延遲時間、監(jiān)測時間等，選擇不同的分析方法應選擇相應的分析時間。7.1 孵育時間選擇終點法時設置，在一點終點法是樣品與試劑混勻開始至反應終點為止的時間，在兩點終點法是第一個吸光度選擇點開始至第二個吸光度選擇點為止的時間。在設置孵育時間時，有些分析方法要特別注意，如選擇溴甲酚綠法測定血清白蛋白時，由于血清中a 1-球蛋白、轉鐵蛋白等也可與澳甲酚綠呈色，盡管其反應速率較白蛋白為慢，但是實際上當血清與白蛋白混合時， “慢反應”已經(jīng)發(fā)

12、生，因此為減少非特異性結合反應，應在溴甲酚綠與血清混合后30s 讀取吸光度。當選擇酶法的Trinder 反應測定葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯時，由于37酶反應較慢，因此必須測定這些酶試劑反應達到終點的時間，自動分析儀用試劑盒一般可以在全部加樣后5 分鐘內(nèi)反應完全，所以應選擇分析儀的最大反應時間。7.2 延遲時間選擇連續(xù)監(jiān)測法或兩點終點法時設置，即在樣品與反應試劑（第二試劑） 混勻開始至第一個吸光度選擇點之間的時間。在連續(xù)監(jiān)測法過程中，當酶與底物混合后需要一定的時間讓酶激活，直至線性反應期才能開始監(jiān)測，有的項目需要用工具酶將內(nèi)源性代謝產(chǎn)物耗盡，消除干擾。一般單試劑法只需要30S,常用項目中谷氨酸氨

13、基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶需要特別注意，但是對于雙底物反應或需要輔酶參與者，通常為1-3min 。7.3 監(jiān)測時間酶促反應延滯期后，在過量底物的存在下，反應速率加快并達到穩(wěn)定的階段， 即酶促反應以恒定的速率進行，不受底物濃度的影響，這段時間稱為線性反應期或零級反應期，自動生化分析儀的監(jiān)測時間即為此期。連續(xù)監(jiān)測法在零級反應期至少應監(jiān)測90-120S或至少4點（3個AA）,少于3個A A不能稱為連續(xù)監(jiān)測法，因為不能計算線性度；監(jiān)測時間過長則容易發(fā)生底物耗盡，可測范圍變窄。8 .計算因子（F 值）和實測F 值 用連續(xù)監(jiān)測法進行酶活性測定時，不需作標準管或標準曲線，根據(jù)摩爾吸光系數(shù)很容易進行酶活性濃

14、度的計算。先測定在線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的變化（AA/min）,以U/L代表酶活性濃度時，則可按下式進行計算：U/L, tC=AA/min x F=AA/min XVX 106/（ £ x V x L）式中V:反應體系總體積（ml）; 106:將mol換算成科mol; e :摩爾吸光系數(shù)（cm2/mol）;v：樣品體積（ml）; L ：比色杯光徑（cm）。當條件固定時，從理論上講V、v和L均為固定值，e值為常數(shù)，所以F值是恒定的。F值對酶的測定十分重要，過高雖然測定的 線性較寬，但重復性差，反之精密度雖好，但檢測線性窄，因此應根據(jù)實際情況進行合理的設置和應用。但是在臨床實際工作中，儀

15、器諸多因素如波長的準確性、半波寬的大小、比色杯光徑及磨損與清潔度、溫控的準確性、加樣系統(tǒng)狀況等若不符合要求或發(fā)生變化都會影響指示物的e值或上述公式中的相關項，因此應在具體儀器條件下，定期檢查和實際測定指示物的實測£值和F值。因為純NAD （P） H溶液不穩(wěn)定，所以 NAD （P） H的e值需用葡萄 糖己糖激酶法實測，實際操作為將某一濃度的葡萄糖溶液重復5-10 次測定，得到相應的一組吸光度A值，求出A - ±s,注意s必須低于規(guī)定的批內(nèi)允許值，再根據(jù)下面兩個公式分別計算出NAD （P） H的實測e值和F值：式中C為標準液濃度（mol/L）。其他一些色素源指示物在不同的介質環(huán)

16、境中，其 £值會發(fā)生程度不等的變化，對5-硫代 -2-硝基苯甲酸、對硝基苯酚、對硝基苯胺等這些可得到高純而穩(wěn)定的指示物，可將其配制在一定的介質中，按臨床標本用的現(xiàn)場試劑和儀器測定吸光度求實測£值及F值。9 .線性度是非線性比率的界線，常用%表示，其計算公式為，式中：k1 為連續(xù)監(jiān)測時間 2/3 內(nèi)前讀數(shù)時間的斜率，k2 為后 2/3 讀數(shù)時間的斜率，k3 為總的斜率，一般設置為15%。對一些酶活性項目，可以適當放寬，當不需要設置檢查界限時，設置其為0。線性百分數(shù)大，說明A k之間已不成線性；超過極限值說明底物不足，檢測結果會變低，應稀釋后重測。10 .底物耗盡限額選擇連續(xù)監(jiān)

17、測法或兩點終點法時設置，不同型號分析儀的設計不一樣，有的為零點與監(jiān)測第一點吸光度的差額，有的為吸光度上升或下降至指定吸光度( MAX-OD/MIN-OD )的數(shù)值。超過限額說明樣品的酶活性非常高，底物消耗太快，在儀器程序規(guī)定的線性反應期內(nèi)吸光度的變化往往不代表真正的酶活力，導致結果偏低，該樣品應稀釋一定的倍數(shù)重新測定。此參數(shù)對于采用負反應分析酶活性的方法甚為重要，下面以丙氨酸氨基轉移酶為例簡述設置MIN-OD 的步驟，選擇一份高活性酶的混合血清，用生理鹽水稀釋， 得到一組從低濃度至高濃度的丙氨酸氨基轉移酶溶液；把這一組溶液按儀器設定的程序進行測定，并打印出反應曲線；從曲線中可以發(fā)現(xiàn)當酶活力達到

18、一定臨界濃度時，該臨界濃度的反應曲線在連續(xù)監(jiān)測時間內(nèi)成線性，但是在監(jiān)測時間后成非線性，即連續(xù)監(jiān)測時間的最后一個讀數(shù)點正好是線性與非線性的臨界點，所以該點的吸光度是在連續(xù)監(jiān)測時間內(nèi)酶促反應沒有發(fā)生底物耗盡時所能達到的最小吸光度值，這個最小吸光度值也就是MIN-OD 。當酶活力高于上述臨界濃度時，反應曲線在連續(xù)監(jiān)測期內(nèi)已不呈線性反應，有些儀器自動選擇彈性速率功能，能自動選擇反應曲線上連續(xù)監(jiān)測期內(nèi)仍呈線性的吸光度數(shù)據(jù)計算結果，使酶活性測定的線性范圍得以擴大，可以減少稀釋及重測次數(shù)、降低成本。11 .試劑吸光度上限、下限試劑吸光度上限為正向反應用，可參考試劑盒說明書數(shù)值折算成所用比色杯的光徑。如試劑盒要求上限為0.4,比色杯光徑 0.6cm,則試劑吸光度上限設置為0.24。 試劑吸光度下限為負向反應用，設置法同試劑吸光度上限。每種試劑都有一定的空白吸光度范圍，試劑空白吸光度的改變往往提示著該試劑的變質，此時應更換合格