蛋白質(zhì)等電點測定

1、蛋白質(zhì)等電點測定及性質(zhì)實驗、目的：了解等電點的意義及其與蛋白質(zhì)分子聚沉能力的關(guān)系。初步學(xué)會測定蛋白質(zhì)等電點的基本方法，了解蛋白質(zhì)的性質(zhì)。、原理：固體顆粒在液體中為什么能夠帶電？當固體與液體接觸時，固體可以從溶液中選擇性吸附某種離子，也可以是固體分子本身發(fā)生電離作用而使離子進入溶液，以致使固液兩相分別帶有不同符號的電荷，由于電中性的要求，帶電表面附近的液體中必有與固體表面電荷 數(shù)量相等但符號相反的多余的反離子。在界面上 帶電表面和反離子 形成了雙電層的結(jié)構(gòu)。在兩種不同物質(zhì)的 界面上，正負電荷分別排列成的面層。對于雙電層的具體結(jié)構(gòu)，一百多年來不同學(xué)者提出了不同的看法。最早于1879年Helmhol

2、z提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chap man修正了平板型模型，提出了擴散雙電層模型；后來 Stern又提出了 Stern模型。根據(jù)O.斯特恩的觀點，一部分反離子由于電性吸引或非電性的特性吸引作用（例如范德華力）而和表面緊密結(jié)合，構(gòu)成 吸附層（或稱緊密層、斯特恩層）。其余的離子則擴散地分布在溶液中，構(gòu)成雙電層的 擴散層（或稱滑移面）。由于帶電表面的吸引作用，在 擴散層中反離子的濃度遠大于同號離子。離表面越遠，過剩的反離子越少，直至在溶液內(nèi)部反離子緊密層：溶液中反離子及溶劑分子受到足夠大的靜電力，范德華力或特性吸附力，而緊密吸附在固體表面上。其余反離子則構(gòu)成擴散層?；瑒用妫褐腹?/p>

3、液兩相發(fā)生相對移動的界面，是凹凸不平的曲面。滑動面至溶液本體間的電勢差稱為Z電勢。固體顆粒帶電量的大小及測量方式？Z電勢只有在固液兩相發(fā)生相對移動時才能呈現(xiàn)出來。Z電勢的大小由Zeta電位表示，其數(shù)值的大小反映了膠粒帶電的程度，其數(shù)值越高表明膠粒帶電越多，擴散層越厚。一般來說，以pH值為橫坐標，Zeta電位為縱坐標作圖，Zeta電位為零對應(yīng)的pH值即為等電點。對于蛋白質(zhì)分子來說：蛋白質(zhì)分子的大小在膠粒范圍內(nèi)，約1? 100微米。大部分蛋白質(zhì)分子的表面都有很多親水集團，這些集團以氫鍵形式與水分子進行水合作用，使水分子吸附在蛋白質(zhì)分子表面而形成一層水合膜，具有親水性；又由于蛋白質(zhì)分子表面的親水集團

4、都帶有電荷，會與極性水分子中的異性電荷吸引形成雙電層。而水合膜和雙電層的存在，使蛋白質(zhì)的分子與分子之間不會相互凝聚，成為比較穩(wěn)定的膠體溶液。如果消除水合膜或雙電層其中一個因素，蛋白質(zhì)溶液就會變得不穩(wěn)定，兩種因素都消除時，蛋白質(zhì)分子就會互相凝聚成較大的分子而產(chǎn)生沉淀。在生活實踐中，常利用蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)沉淀或分離蛋白質(zhì)。如做豆腐、肉皮凍就是利用蛋白質(zhì)的膠凝作用。蛋白質(zhì)分子所帶的電荷與溶液的pH值有很大關(guān)系，蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在酸性溶液中的氨基酸分子氨基形成-NH3+而帶正在堿性溶液中竣基形成-C00一而帶負電電， COO-COOJ + 0H- NH2 兼性癢孑 pH>pI pK = pl

5、pl電殛申：拓向配覆不暮動蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷為零時的pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點（PI）。其定義為:在某一pH的溶液中，蛋白質(zhì)解離成陽離子和陰離子的趨勢或程度相等時，呈電中性，此時溶液的pH稱為該蛋白質(zhì)的等電點。等電點的應(yīng)用：主要用于蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)的分離、提純和電泳。蛋白質(zhì)等電點的測量方式：溶解度最低時的溶液pH。在等電點時，蛋白質(zhì)分子在電場中不向任何一極移動，而且分子與分子間因碰撞而引起聚沉的傾向增加，所以這時可以使蛋白質(zhì)溶液的粘度、滲透壓均減到最低，且溶液變混濁。蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最小，最容易沉淀析出。蛋白質(zhì)等電點的測定各種蛋白質(zhì)的等電點都不相同，但偏酸性的較多，如牛乳中的酪蛋白的等

6、電點是4.74.8 ，血紅蛋白等電點為6.76.8 ，胰島素是5.35.4 ，魚精蛋白是一個典型的堿性蛋白，其等電點在pH12.012.4 。本實驗采用蛋白質(zhì)在不同pH溶液中形成的混濁度來確定，即混濁度最大時的pH值即為該種蛋白質(zhì)的等電點值，這個方法雖然不很準確，但在一般實驗條件下都能進行，操作也 簡便。蛋白質(zhì)的等電點比較準確的方法是采用等電聚焦技術(shù)加以準確測定，但需一定的實驗條件。等電聚焦電泳（IEF，isoelectric focusing electrophoresis利用特殊的一種緩沖液（兩性電解質(zhì)）在凝膠（常用聚丙烯酰胺凝膠）內(nèi)制造一個pH梯度，電泳時每種蛋白質(zhì)就將遷移到等于其等電點

7、（pl ）的pH處（此時此蛋白質(zhì)不再帶有凈的正或負電荷），形成一個很窄的區(qū)帶。IEF 的基本原理在IEF的電泳中，具有pH梯度的介質(zhì)其分布是從陽極到陰極，pH值逐漸增大。如前所述，蛋白質(zhì)分子具有兩性解離及等電點的特征，這樣在堿性區(qū)域蛋白質(zhì)分子帶負電荷向陽極移動，直至某一 pH位點時失去電荷而停止移動，此處介質(zhì)的pH恰好等于聚焦蛋白質(zhì)分子的等電點（pl ）。同理，位于酸性區(qū)域的蛋白質(zhì)分子帶正電荷向陰極移動，直到它們的等電點上聚焦為止?？梢娫谠摲椒ㄖ?，等電點是蛋白質(zhì)組分的特性量度，將等電點不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場內(nèi)經(jīng)過一定時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點相應(yīng)的pH位

8、置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。沉淀反應(yīng)：蛋白質(zhì)在某種理化條件下，蛋白膠體溶液的水化層或者電荷層破壞，蛋白膠體相互聚集的現(xiàn)象。主要的沉淀現(xiàn)象有（1）鹽析：在蛋白質(zhì)水溶液中加入足量的鹽類（如硫酸銨），可析出沉淀，稀釋后能溶解并仍保持原來的性質(zhì)，不影響蛋白質(zhì)的活性。這是一個可逆的過程，可用于蛋白質(zhì)的分離與初級提純。（ 2）變性：在重金屬鹽、強酸、強堿、加熱、紫外線等作用下，引起蛋白質(zhì)某些理性質(zhì)改變和生物學(xué)功能喪失。這是一個不可逆過程。4 ）加入生物堿試劑（含氮的堿性物質(zhì)）（ 3）加入一定量的溶劑如乙醇、丙酮，它們與蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，破壞水化膜，短時:能使生物堿沉淀或作用產(chǎn)生顏色反應(yīng)的物質(zhì)，稱為生物

9、堿試劑。當溶液的 試PH小于PI時，蛋白質(zhì)為陽離子，能與生物堿劑的陰離子結(jié)合而生成沉淀。酪蛋白是牛奶蛋白質(zhì)的主要成分，常溫下在水中可溶解 0.81.2%,微溶于25度水和有機溶劑，溶于稀堿和濃酸中，能吸收水分。當浸入水中則迅速膨脹。在牛奶中以磷酸二鈣、三鈣或兩者的復(fù)合物形式存在。構(gòu)造極為復(fù)雜，沒有確定的分子式。分子量約為57000375000,在牛奶中約含 3%占牛奶蛋白質(zhì)的 80%三、器材及試劑：1 .器材：試管1.5X厘米（X 9）。吸管1毫升（X 2） , 2毫升（X 2） , 10毫升（X 2）。 容量瓶50毫升（X 2） , 500毫升（X 1）。試管架。2 .試劑：0.01mol

10、? L-1醋酸溶液。0.1mol ? L-1醋酸溶液。1 mol ? L-1醋酸溶液。1 mol ? L-1氫氧化鈉溶液（氫氧化鈉和醋酸溶液的濃度要標定）。酪蛋白。四、操作步驟：1 .制備蛋白質(zhì)膠液（1）稱取酪蛋白3克，放在燒杯中，加入 40C的蒸儲水。（2）加入50毫升1 mol ? L-1氫氧化鈉溶液，微熱攪拌直到蛋白質(zhì)完全溶解為止。將溶解好的蛋白溶液轉(zhuǎn)移到500毫升容量瓶中，并用少量蒸儲水洗凈燒杯，一并倒入容量瓶。（3）在容量瓶中再加入1 mol ? L-1醋酸溶液50毫升，搖勻。（4）加入蒸儲水定容至500毫升，得到略現(xiàn)渾濁的，在0.1 mol ? L-1NaA0液中的酪 蛋白膠體。2

11、 . 等電點測定按下表順序在各管中加入蛋白質(zhì)膠液，并準確地加入蒸儲水和各種濃度的醋酸溶液，加入后立即搖勻。管號蛋白質(zhì)膠液（金）H20（金）-10.01 mol ? LHAC-10.1mol ? LHAC（»#）1 mol ? L-1HAC（»#）PH觀察0分鐘10分鐘20分鐘118.380.625.9217.751.25一一5.6318.75一0.25一5.3418.50一0.50一5.0518.00一1.00一4.7617.00一2.00一4.4715.00一4.00一4.1811.00一8.00一3.8917.40一一1.603.5觀察各管產(chǎn)生的混濁并根據(jù)混濁度來判斷酪

12、蛋白的等電點。觀察時可用+, +, +,表示渾濁度。3 .蛋白質(zhì)性質(zhì)實驗(1) 蛋白質(zhì)的鹽析在試管里加入12毫升蛋白質(zhì)的水溶液，然后逐滴加入硫酸鏤飽和溶液，觀察現(xiàn)象，有無白色渾濁產(chǎn)生。滴加過程中不要搖動試管，現(xiàn)象不明顯時，多加幾滴硫酸鏤飽和溶液。(2) 蛋白質(zhì)的變性在試管里加入2毫升蛋白質(zhì)的水溶液，沸水浴加熱5分鐘，觀察現(xiàn)象。把試管里的下層物質(zhì)取出一些放在水里，觀察現(xiàn)象。在試管里加入3毫升蛋白質(zhì)的水溶液，加入 1毫升硫酸銅溶液，觀察現(xiàn)象。(有無淡藍色絮狀渾濁沉淀產(chǎn)生)。把少量沉淀放入盛有蒸儲水的試管里，觀察沉淀是否溶解。五、思考題1、在等電點時蛋白質(zhì)的溶解度為什么最低？請結(jié)合你的實驗結(jié)果和蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)加以說明。在等電點時，蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零(即正負電荷相等)，此時蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀，所以蛋白質(zhì)在等電點時，其溶解度最小，最易形成沉淀物。2、本實驗中，酪