生物傳感器知識

1、2021/3/2312021/3/232 由于生物傳感器它具有集信息采集、轉換、由于生物傳感器它具有集信息采集、轉換、傳輸、表達于一身的特點傳輸、表達于一身的特點,且其測定簡便、快速且其測定簡便、快速,裝置簡單裝置簡單,價格低廉價格低廉,選擇性優(yōu)異選擇性優(yōu)異,應用面廣等眾多應用面廣等眾多優(yōu)點優(yōu)點,因而深受研究者的青睞。同時因而深受研究者的青睞。同時,由于生物傳由于生物傳感器易于組成生物傳感器陣列感器易于組成生物傳感器陣列,通過與微型流路、通過與微型流路、微型泵和微型閥的配合微型泵和微型閥的配合,構成生物分析芯片構成生物分析芯片,從而從而可實現(xiàn)對多個參數(shù)同時進行檢測。由此可見可實現(xiàn)對多個參數(shù)同時

2、進行檢測。由此可見,基基于生物傳感器的生物分析芯片的應用于生物傳感器的生物分析芯片的應用,將成為醫(yī)將成為醫(yī)療檢測儀器的一個重要發(fā)展方向。療檢測儀器的一個重要發(fā)展方向。2021/3/233 生物傳感器生物傳感器(Biosensor)(Biosensor)是一種以生物活性單元（如是一種以生物活性單元（如: :酶、抗體、核酸、細胞等）作為敏感基元酶、抗體、核酸、細胞等）作為敏感基元, ,對被分析對被分析物具有物具有高度選擇性高度選擇性的現(xiàn)代化分析儀器單元。它通過的現(xiàn)代化分析儀器單元。它通過各種物理、化學換能器捕捉目標物與敏感基元之間各種物理、化學換能器捕捉目標物與敏感基元之間的反應的反應, ,然后將

3、反應的程度用離散或連續(xù)的數(shù)字電信然后將反應的程度用離散或連續(xù)的數(shù)字電信號表達出來號表達出來, ,從而得出被分析物的濃度。從而得出被分析物的濃度。19621962年年ClarkClark在紐約自然科學學會的論文集中首次提出了在紐約自然科學學會的論文集中首次提出了“在化學電極的敏感膜中加入酶以實現(xiàn)對目標物進在化學電極的敏感膜中加入酶以實現(xiàn)對目標物進行選擇性分析行選擇性分析”的設想。這一設想經過的設想。這一設想經過UpdikeUpdike等人等人的發(fā)展后的發(fā)展后, ,于于19691969年由年由GuilbaultGuilbault和和MontalvoMontalvo得以實得以實現(xiàn)?，F(xiàn)。 2021/3

4、/234 就生物傳感器而言就生物傳感器而言, ,它的敏感元件主要由它的敏感元件主要由兩部分組兩部分組成成: :敏感基元和換能器敏感基元和換能器。敏感基元指的是對目標物。敏感基元指的是對目標物進行選擇性作用的生物活性單元。最先被使用的進行選擇性作用的生物活性單元。最先被使用的是具有高度選擇催化活性的酶。是具有高度選擇催化活性的酶。 酶或是以物理方法（包埋、吸附等）酶或是以物理方法（包埋、吸附等）, ,或是以化學或是以化學方法方法 (a) (a) 質量檢測質量檢測, ,如質量如質量, ,頻率等。頻率等。 (b) (b) 電特性檢測電特性檢測, ,如電量如電量, ,電阻等。電阻等。 (c) (c)

5、光檢測光檢測, ,如折射角如折射角, ,光強等。光強等。 (d) SPR (d) SPR (e) (e) 光譜檢測光譜檢測 (f) Mach-Zehnder Interferometer. A: (f) Mach-Zehnder Interferometer. A: 被檢測被檢測物質物質, , R: R: 敏感物質。見下圖。敏感物質。見下圖。2021/3/235 (a) 質量檢測，如質量，頻率等。質量檢測，如質量，頻率等。(b) 電特性檢測，如電量，電阻等。電特性檢測，如電量，電阻等。(c) 光檢測，如折射角，光強等。光檢測，如折射角，光強等。(d) SPR (e) 光譜檢測光譜檢測 (f)

6、Mach-Zehnder Interferometer. A: 被檢測物質，被檢測物質， R: 敏感物質。敏感物質。圖圖8-2. 生物傳感器的分類生物傳感器的分類2021/3/236 若是按照檢測手段來分類的話若是按照檢測手段來分類的話, ,生物芯片中應用的主要檢生物芯片中應用的主要檢測手段有以下幾種測手段有以下幾種: : 質量法質量法。這種方法主要是對傳感器上質量變化進行檢測。這種方法主要是對傳感器上質量變化進行檢測, ,常用方法有常用方法有QCMQCM等。等。 電特性檢測電特性檢測。這種方法主要通過傳感器的電特性參量的變。這種方法主要通過傳感器的電特性參量的變化進行檢測。主要有電流法化進行

7、檢測。主要有電流法, ,電位法電位法, ,電導法等。電導法等。 光信號檢測。光信號檢測。這種方法主要是利用光特性的變化量進行檢這種方法主要是利用光特性的變化量進行檢測測, ,如折射角如折射角, ,光強等光強等 SPRSPR法法。這是最近幾年出現(xiàn)的一種檢測方法。這是最近幾年出現(xiàn)的一種檢測方法, ,表面等離子體表面等離子體子共振子共振(SPR)(SPR)技術是一種簡單、直接的傳感技術。它通過技術是一種簡單、直接的傳感技術。它通過測量金屬表面附近折射率的變化測量金屬表面附近折射率的變化, ,來研究物質的性質。表來研究物質的性質。表面等離子體子共振傳感器已經成為生物傳感器研究領域的面等離子體子共振傳感

8、器已經成為生物傳感器研究領域的熱點。熱點。 光譜法光譜法。 Mach-Zehnder InterferometerMach-Zehnder Interferometer。 所謂的分析生物芯片技術所謂的分析生物芯片技術, ,就是采用生物傳感器陣列作為就是采用生物傳感器陣列作為檢測元件檢測元件, ,利用微加工技術構成利用微加工技術構成mTASmTAS系統(tǒng)系統(tǒng), ,從而實現(xiàn)復雜體從而實現(xiàn)復雜體系下的血液多參數(shù)微量分析。因而在生物芯片技術研究領系下的血液多參數(shù)微量分析。因而在生物芯片技術研究領域中域中, ,一個極為重要的核心內容就是生物傳感器。一個極為重要的核心內容就是生物傳感器。2021/3/237

9、 生物傳感器的分類法生物傳感器的分類法 敏感基元通過交聯(lián)、聚合等方法固定在化學傳感敏感基元通過交聯(lián)、聚合等方法固定在化學傳感器的敏感膜中器的敏感膜中, ,然后以化學電極作為換能器測定酶催然后以化學電極作為換能器測定酶催化目標物反應所生成的特定產物的濃度化目標物反應所生成的特定產物的濃度, ,從而間接地從而間接地測定目標物的濃度。隨著物理檢測手段的引入測定目標物的濃度。隨著物理檢測手段的引入, ,人們人們已成功地把抗體、已成功地把抗體、DNADNA聚合物、核酸、細胞受體和完聚合物、核酸、細胞受體和完整細胞等具有特異選擇性作用功能的生物活性單元用整細胞等具有特異選擇性作用功能的生物活性單元用作了敏

10、感基元。作了敏感基元。 根據根據敏感基元敏感基元的工作原理的不同的工作原理的不同, ,生物傳感器可以生物傳感器可以被分為兩類被分為兩類: :即即催化型生物傳感器和親和型生物傳感催化型生物傳感器和親和型生物傳感器器。前者利用了如酶等生物敏感基元的專一性和催化。前者利用了如酶等生物敏感基元的專一性和催化性性, ,它檢測的是整個反應動力學過程的總效應它檢測的是整個反應動力學過程的總效應; ;后者利后者利用了分子間特異的親和性用了分子間特異的親和性, ,如免疫傳感器等如免疫傳感器等, ,它檢測的它檢測的是熱力學平衡的結果。是熱力學平衡的結果。2021/3/238 目前目前, ,生物傳感器中主要的生物敏

11、感基元有生物傳感器中主要的生物敏感基元有4 4種種: : 酶酶 酶是生化反應的高效催化劑酶是生化反應的高效催化劑, ,對目標物具有高度的專對目標物具有高度的專一性。在反應過程中一性。在反應過程中, ,利用氧化還原酶的電子轉移。利用氧化還原酶的電子轉移?；蚶梅磻昂竽繕宋锘虍a物的濃度變化進行檢測?；蚶梅磻昂竽繕宋锘虍a物的濃度變化進行檢測。基于酶的生物傳感器目前應用較為廣泛?；诿傅纳飩鞲衅髂壳皯幂^為廣泛。 抗原和抗體抗原和抗體 抗原是能被動物組織成為一種外源性物質進行特異性抗原是能被動物組織成為一種外源性物質進行特異性識別的物質分子識別的物質分子, ,相伴隨產生的防護性機制稱之為免相伴

12、隨產生的防護性機制稱之為免疫反應。通過疫反應。通過抗原和抗體抗原和抗體在換能器在換能器表面的結合表面的結合,利用質量檢測的方法或利用質量檢測的方法或SPRSPR方法進行檢測。方法進行檢測。 2021/3/239受體受體利用受體與特定目標物的結合利用受體與特定目標物的結合, ,通過通過QCMQCM或或SPRSPR技技術進行檢測。目前術進行檢測。目前, ,作為識別元件用于生物傳感作為識別元件用于生物傳感器研究實驗器研究實驗, ,大部分只限于煙酰胺乙酰膽堿受體大部分只限于煙酰胺乙酰膽堿受體（n n-AChR-AChR）, ,這主要是由于其他受體在生物體中這主要是由于其他受體在生物體中只存在很小量只存

13、在很小量, ,不易分離而大量獲得。不易分離而大量獲得。核酸核酸核酸具有最高的生物選擇性核酸具有最高的生物選擇性, ,利用核酸分子雜交利用核酸分子雜交的原理對目標物進行檢測的核酸生物傳感器從的原理對目標物進行檢測的核酸生物傳感器從理論上講具有極其美好的發(fā)展前景理論上講具有極其美好的發(fā)展前景, ,因而成為目因而成為目前生物傳感器研究領域最前沿的研究課題。前生物傳感器研究領域最前沿的研究課題。2021/3/2310生物傳感器分類生物傳感器分類生物芯片2021/3/23112021/3/23122021/3/23132021/3/231422021/3/23152021/3/23162021/3/23

14、172021/3/2318尿酸測定尿酸測定2021/3/23192021/3/23202021/3/23212021/3/23222021/3/23232021/3/23242021/3/23252021/3/23262021/3/23272021/3/23282021/3/23292021/3/23302021/3/23312021/3/23322021/3/23332021/3/23342021/3/23352021/3/23362021/3/2337 Fig1 Measurement system A: carrier fluid (buffer) B: urea sample; C:

15、FIA pump; D: enzyme column; E: pH-ISFET; F: flow-through cell; R: reference electrode M: signal manage circuit; W: waste solution. An FIA System with enzyme column and ISFET detector for determination of Urea2021/3/2338fig3 urea concentration calibrated curve2021/3/23392021/3/2340 生物芯片技術生物芯片技術, ,被譽為

16、被譽為2121世紀生命科學的支撐技術世紀生命科學的支撐技術, ,是半導是半導體技術和生物技術聯(lián)姻的結果體技術和生物技術聯(lián)姻的結果, ,是便攜式生化分析儀器的技術是便攜式生化分析儀器的技術核心。該技術利用微電子工業(yè)技術核心。該技術利用微電子工業(yè)技術, ,將現(xiàn)在生命科學研究中將現(xiàn)在生命科學研究中“各自為陣各自為陣”的分析過程集成在一塊指甲大小的生物芯片上。的分析過程集成在一塊指甲大小的生物芯片上。使生命科學及醫(yī)學工作者可以在方寸之上進行和完成一系列實使生命科學及醫(yī)學工作者可以在方寸之上進行和完成一系列實驗程序驗程序, ,專家們因此將其稱之為專家們因此將其稱之為“微縮芯片實驗室微縮芯片實驗室”。它的

17、發(fā)。它的發(fā)展同當年需要數(shù)間房屋放置的分離元件計算機被微縮成現(xiàn)在只展同當年需要數(shù)間房屋放置的分離元件計算機被微縮成現(xiàn)在只有筆記本大小的電腦有異曲同工之效。采用該技術可進行生命有筆記本大小的電腦有異曲同工之效。采用該技術可進行生命科學和醫(yī)學科學所涉及的各種生物化學反應實驗科學和醫(yī)學科學所涉及的各種生物化學反應實驗, ,從而達到對從而達到對各項生化指標進行測試分析的目的。各項生化指標進行測試分析的目的。生物芯片生物芯片2021/3/2341生物芯片技術的出現(xiàn)將會給生命科學、醫(yī)學科學、化學、新生物芯片技術的出現(xiàn)將會給生命科學、醫(yī)學科學、化學、新藥開發(fā)、生物武器研制、外太空探索、司法鑒定、食品和環(huán)藥開發(fā)

18、、生物武器研制、外太空探索、司法鑒定、食品和環(huán)境監(jiān)測等領域帶來一場革命。正是由于生物芯片技術對科學境監(jiān)測等領域帶來一場革命。正是由于生物芯片技術對科學研究的發(fā)展具有極其重要的意義研究的發(fā)展具有極其重要的意義,以及它的廣泛的應用前景及以及它的廣泛的應用前景及巨大的商業(yè)利益巨大的商業(yè)利益,世界上許多國家和地區(qū)以高額投入和大量的世界上許多國家和地區(qū)以高額投入和大量的人力對此領域開展了大量的基礎研究和應用開發(fā)人力對此領域開展了大量的基礎研究和應用開發(fā),并形成了一并形成了一批相關產業(yè)。批相關產業(yè)。 美國美國財富財富雜志曾撰文指出雜志曾撰文指出“微處理器使我們的經微處理器使我們的經濟發(fā)生了根本變化濟發(fā)生了

19、根本變化,給人類帶來了巨大的財富給人類帶來了巨大的財富,改變了我們改變了我們的生活方式。然而的生活方式。然而,生物芯片給人類帶來的影響可能更生物芯片給人類帶來的影響可能更大。大?！笔聦嵰呀洷砻魇聦嵰呀洷砻?生物芯片技術已經成為全球科學界生物芯片技術已經成為全球科學界矚目的矚目的“熱點熱點”,是繼微電子技術之后是繼微電子技術之后,高科技領域的又一高科技領域的又一場決戰(zhàn)。場決戰(zhàn)。2021/3/2342目前目前, ,國內外研究單位所研發(fā)的生物芯片國內外研究單位所研發(fā)的生物芯片, ,如果按應用領域分類如果按應用領域分類, ,可以分為可以分為基因芯片基因芯片、蛋白質分析用生物芯片蛋白質分析用生物芯片、P

20、CRPCR芯片芯片、以及、以及血液分析用生物芯片血液分析用生物芯片等幾類等幾類; ;如果按內在集成功能分類如果按內在集成功能分類, ,可以分可以分為主動式生物芯片和被動式生物芯片兩類。為主動式生物芯片和被動式生物芯片兩類。被動式生物芯片被動式生物芯片的實質是在面積不大的基片上有序地點的實質是在面積不大的基片上有序地點陣排列了一系列固定于一定位置的可尋址的敏感物質陣排列了一系列固定于一定位置的可尋址的敏感物質, ,結合或結合或反應在相同條件下進行。反應結果用各種物理或化學手段進行反應在相同條件下進行。反應結果用各種物理或化學手段進行轉換成電信號轉換成電信號, ,通過計算機進行分析處理通過計算機進

21、行分析處理, ,綜合成可讀的數(shù)據信綜合成可讀的數(shù)據信息。利用被動式生物芯片進行芯片分析可以大大提高檢測效率息。利用被動式生物芯片進行芯片分析可以大大提高檢測效率, ,減少工作量減少工作量, ,增加可比性。但實驗人員無法對芯片上的生物及增加可比性。但實驗人員無法對芯片上的生物及化學反應進行動力學以及反應特異性的人為地控制。被動式生化學反應進行動力學以及反應特異性的人為地控制。被動式生物芯片構成簡單物芯片構成簡單, ,目前目前, ,國內外大多數(shù)研究單位所研發(fā)的多是這國內外大多數(shù)研究單位所研發(fā)的多是這類芯片。在人類基因組計劃中發(fā)揮重要作用的基因芯片就屬于類芯片。在人類基因組計劃中發(fā)揮重要作用的基因芯

22、片就屬于被動式生物芯片。被動式生物芯片。2021/3/2343 主動式生物芯片主動式生物芯片的實質是在被動式生物的實質是在被動式生物芯片的基礎上芯片的基礎上, ,在基片上同時集成有微型流在基片上同時集成有微型流路路, ,微型閥和微型泵等部分微型閥和微型泵等部分, ,利用他們對發(fā)利用他們對發(fā)生在芯片上的生物及化學反應進行人為控生在芯片上的生物及化學反應進行人為控制。主動式生物芯片又被稱為芯片型實驗制。主動式生物芯片又被稱為芯片型實驗室（室（Lab on a chipLab on a chip）, ,它是它是9090年代后出現(xiàn)年代后出現(xiàn)的一個新的研究領域。顧名思義的一個新的研究領域。顧名思義, ,

23、它是以芯它是以芯片分析為基礎片分析為基礎, ,其功能已從單一分析測定發(fā)其功能已從單一分析測定發(fā)展為集各種分析化學所需的實驗室基本操展為集各種分析化學所需的實驗室基本操作于一體的作于一體的“微型實驗室微型實驗室”。2021/3/2344“芯片實驗室芯片實驗室”是一個理想化的新概念是一個理想化的新概念, ,而而mTAS(Miniaturized mTAS(Miniaturized Total Analysis System)Total Analysis System)系統(tǒng)則是一個具體的科學新概念。圖系統(tǒng)則是一個具體的科學新概念。圖1-11-1為為P. Bergveld P. Bergveld 于于

24、19941994年在年在 “The challenge of developing The challenge of developing mTAS”mTAS”中給出的中給出的“芯片實驗室芯片實驗室”結構示意圖。結構示意圖。圖圖8-1 芯片實驗室概念圖芯片實驗室概念圖2021/3/2345 生物芯片的種類生物芯片的種類生物芯片技術的主要用途就是對各種生物化學參數(shù)進行快生物芯片技術的主要用途就是對各種生物化學參數(shù)進行快速、簡便、高效、準確的檢測速、簡便、高效、準確的檢測, ,如果按檢測內容類分類的話如果按檢測內容類分類的話, ,生物芯片可以分為以下幾類生物芯片可以分為以下幾類: : 蛋白質檢測生

25、物芯片蛋白質檢測生物芯片。這種生物芯片主要是利用毛細管電泳。這種生物芯片主要是利用毛細管電泳檢測技術檢測技術, ,通過不同種類蛋白質分子量的不同進行檢測。通過不同種類蛋白質分子量的不同進行檢測。 DNADNA檢測生物芯片檢測生物芯片。這種生物芯片主要是利用。這種生物芯片主要是利用DNADNA螺旋結構的螺旋結構的互補性互補性, ,對不同種類的對不同種類的DNADNA分子進行檢測。分子進行檢測。 血液參數(shù)檢測生物芯片血液參數(shù)檢測生物芯片。這種生物芯片是利用生物酶催化的。這種生物芯片是利用生物酶催化的單一性單一性, ,利用電化學方法利用電化學方法, ,或熒光檢測方法對不同的生化參數(shù)或熒光檢測方法對不

26、同的生化參數(shù)進行檢測。進行檢測。 PCRPCR生物芯片生物芯片。這種生物芯片是利用。這種生物芯片是利用DNADNA雙螺旋結構在酶的催雙螺旋結構在酶的催化下化下, ,在一定溫度條件下會裂解、復制的特性在一定溫度條件下會裂解、復制的特性, ,進行進行DNADNA分子的分子的大量復制大量復制, ,是進行是進行DNADNA檢測的必要步驟。檢測的必要步驟。2021/3/2346 若是按照檢測手段來分類的話若是按照檢測手段來分類的話, ,生物芯片中應用的主要檢測手段生物芯片中應用的主要檢測手段有以下幾種有以下幾種: : 質量法質量法。這種方法主要是對傳感器上質量變化進行檢測。這種方法主要是對傳感器上質量變

27、化進行檢測, ,常用方常用方法有法有QCMQCM等。等。 電特性檢測電特性檢測。這種方法主要通過傳感器的電特性參量的變化進行。這種方法主要通過傳感器的電特性參量的變化進行檢測。主要有電流法檢測。主要有電流法, ,電位法電位法, ,電導法等。電導法等。 光信號檢測。這種方法主要是利用光特性的變化量進行檢測光信號檢測。這種方法主要是利用光特性的變化量進行檢測, ,如如折射角折射角, ,光強等光強等 SPRSPR法法。這是最近幾年出現(xiàn)的一種檢測方法。這是最近幾年出現(xiàn)的一種檢測方法, ,表面等離子體子共振表面等離子體子共振(SPR)(SPR)技術是一種簡單、直接的傳感技術。它通過測量金屬表面技術是一種

28、簡單、直接的傳感技術。它通過測量金屬表面附近折射率的變化附近折射率的變化, ,來研究物質的性質。表面等離子體子共振傳來研究物質的性質。表面等離子體子共振傳感器已經成為生物傳感器研究領域的熱點。感器已經成為生物傳感器研究領域的熱點。 光譜法光譜法。 Mach-Zehnder InterferometerMach-Zehnder Interferometer。 所謂的分析生物芯片技術所謂的分析生物芯片技術, ,就是采用生物傳感器陣列作為檢測元就是采用生物傳感器陣列作為檢測元件件, ,利用微加工技術構成利用微加工技術構成mTASmTAS系統(tǒng)系統(tǒng), ,從而實現(xiàn)復雜體系下的血液多從而實現(xiàn)復雜體系下的血液

29、多參數(shù)微量分析。因而在生物芯片技術研究領域中參數(shù)微量分析。因而在生物芯片技術研究領域中, ,一個極為重要一個極為重要的核心內容就是生物傳感器。的核心內容就是生物傳感器。2021/3/2347 聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是是8080年年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優(yōu)點產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優(yōu)點; ;能在一個試管內將所要研究能在一個試

30、管內將所要研究 的目的基因或某一的目的基因或某一DNADNA片段于片段于數(shù)小時內擴增至十萬乃至百萬倍數(shù)小時內擴增至十萬乃至百萬倍, ,使肉眼能直接觀察和判使肉眼能直接觀察和判斷斷; ;可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的的DNADNA供分析研供分析研 究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情的事情, ,用用PCRPCR幾小時便可完成。幾小時便可完成。PCRPCR技術是生物醫(yī)學領域技術是生物醫(yī)學領域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。 PCR芯片芯片2021/3/2348 1 PC

31、R的定義的定義 聚合酶鏈式反應即聚合酶鏈式反應即PCRPCR是指在引物指導下由酶催化是指在引物指導下由酶催化的對特定的克隆或基因組的對特定的克隆或基因組DNADNA序列進行的擴增反應。序列進行的擴增反應。該方法最早由該方法最早由Mullis5Mullis5于于19871987年提出的年提出的, ,現(xiàn)已成為分現(xiàn)已成為分子生物學實驗室常規(guī)的操作子生物學實驗室常規(guī)的操作, ,并已實現(xiàn)自動化。模板并已實現(xiàn)自動化。模板DNADNA中包含目的序列中包含目的序列, ,長短由幾十到幾千個堿基對不等。長短由幾十到幾千個堿基對不等。反應緩沖液中含有相對過量的寡核苷酸引物和反應緩沖液中含有相對過量的寡核苷酸引物和4

32、 4種脫種脫氧核苷酸氧核苷酸, ,反應由一種對熱穩(wěn)定的反應由一種對熱穩(wěn)定的DNADNA聚合酶聚合酶, ,如常用如常用的的Taq DNATaq DNA聚合酶催化聚合酶催化, ,通過對目的序列的指數(shù)性擴增通過對目的序列的指數(shù)性擴增, ,結果可以獲得數(shù)百萬倍拷貝的目的序列。盡管結果可以獲得數(shù)百萬倍拷貝的目的序列。盡管PCRPCR本本身只能用于擴增身只能用于擴增DNADNA, ,但也可用但也可用RNARNA做最初材料反轉錄做最初材料反轉錄生成生成DNADNA后再進行后再進行PCRPCR。2021/3/2349 基因芯片主要有兩種類型基因芯片主要有兩種類型: : 其一可稱為微芯片其一可稱為微芯片, ,即

33、利用微加工技術即利用微加工技術, ,在固相載體上刻蝕在固相載體上刻蝕出基于不同目的而形狀各異的生物樣品微型反應池和類似出基于不同目的而形狀各異的生物樣品微型反應池和類似于毛細血管電泳的分離和檢測系統(tǒng)等。于毛細血管電泳的分離和檢測系統(tǒng)等。 另一類可稱為寡核苷酸陣列芯片另一類可稱為寡核苷酸陣列芯片。是借助定點固相合成技。是借助定點固相合成技術或探針固定化技術術或探針固定化技術, ,將一系列不同序列的寡核苷酸按陣將一系列不同序列的寡核苷酸按陣列分布固定于固象載體上列分布固定于固象載體上, ,再基于核酸雜交原理再基于核酸雜交原理, ,實現(xiàn)對生實現(xiàn)對生物樣品中靶基因序列進行測定物樣品中靶基因序列進行測定

34、, ,目前常指的基因芯片屬于目前常指的基因芯片屬于第二種類型第二種類型, ,其主要特點是一個芯片可完成數(shù)百次的常規(guī)其主要特點是一個芯片可完成數(shù)百次的常規(guī)測試測試, ,簡化了測試過程簡化了測試過程, ,使得在短時間內可采集大量信息。使得在短時間內可采集大量信息。 2021/3/2350 從從8080年代到年代到9090年代初在不到年代初在不到1010年的時年的時間內間內, ,基因芯片得以迅速發(fā)展基因芯片得以迅速發(fā)展, ,并呈現(xiàn)發(fā)展并呈現(xiàn)發(fā)展高峰高峰, ,目前的美國目前的美國AffymetrixAffymetrix公司已可以在公司已可以在約約1 1平方厘米的玻璃芯片上固定包含平方厘米的玻璃芯片上固

35、定包含4040萬種萬種寡核苷酸在內的寡核苷酸在內的DNADNA探針探針, ,1010塊這樣的芯片塊這樣的芯片即可對人類的全部基因組序列進行掃描即可對人類的全部基因組序列進行掃描。 2021/3/2351 一一, PCR芯片的分類芯片的分類 目前目前, ,市場上所見到的市場上所見到的PCRPCR擴增器（熱循環(huán)儀多為離心管擴增器（熱循環(huán)儀多為離心管式）反應室容積較大式）反應室容積較大, ,升降溫相對緩慢升降溫相對緩慢, ,時間長。這不但耗時間長。這不但耗費昂貴的引物、聚合酶及載液等費昂貴的引物、聚合酶及載液等, ,并且由于反應物量大并且由于反應物量大, ,單單次循環(huán)次循環(huán)/ /擴增擴增( (變性、

36、退火、延伸變性、退火、延伸) )所需循環(huán)時間較長所需循環(huán)時間較長, ,對于對于單個單個DNADNA分子分子1k1k拷貝的擴增拷貝的擴增, ,一般要一般要1010次熱循環(huán)以上次熱循環(huán)以上, ,所需所需時間長達數(shù)十分鐘甚至幾個小時。對于可方便檢測的時間長達數(shù)十分鐘甚至幾個小時。對于可方便檢測的10k10k拷貝以上的擴增所耗費的時間更長。這限制拷貝以上的擴增所耗費的時間更長。這限制PCRPCR技術在生技術在生物及醫(yī)學領域中的應用。而九十年代是物及醫(yī)學領域中的應用。而九十年代是MEMSMEMS技術逐漸成熟技術逐漸成熟的年代的年代, ,利用利用MEMSMEMS中的微機械加工技術制作的微小反應室中的微機械

37、加工技術制作的微小反應室, ,不但實現(xiàn)了器件的微型化、用樣的微量化不但實現(xiàn)了器件的微型化、用樣的微量化, ,倍增的快速化倍增的快速化, ,并且進一步實現(xiàn)并且進一步實現(xiàn)DNADNA的擴增、分離及檢測的單片集成化的擴增、分離及檢測的單片集成化, ,是是一種可望取代一種可望取代PCRPCR熱循環(huán)儀等的新型熱循環(huán)儀等的新型LOC (Lab-On-Chip)LOC (Lab-On-Chip), ,是九十年代中期以后國際上生物芯片技術與是九十年代中期以后國際上生物芯片技術與MEMSMEMS技術的研技術的研究熱點之一究熱點之一1-21-2。2021/3/2352國際上對國際上對PCR生物芯片的研究主要集中在

38、微井式、生物芯片的研究主要集中在微井式、連續(xù)流式和集成式三種形式連續(xù)流式和集成式三種形式。 1.微井式微井式PCR芯片芯片圖1-1 微井式PCR結構示意圖19931993年加州大學年加州大學Berkeley3-4Berkeley3-4分校的分校的BSACBSAC中心與加州的中心與加州的LawrenceLawrence國家實驗室等聯(lián)合報道了一種基于微機械加工技國家實驗室等聯(lián)合報道了一種基于微機械加工技術的術的PCRPCR芯片芯片, ,這是所見到的最早的這是所見到的最早的PCRPCR生物芯片生物芯片。 2021/3/2353 2.連續(xù)流式連續(xù)流式PCR芯片芯片相對相對PCR擴增器而言擴增器而言,連

39、續(xù)流連續(xù)流PCR芯片技術研究在國際上還處于剛剛芯片技術研究在國際上還處于剛剛起步的階段。起步的階段。 PCR芯片技術像其它高新技術一樣芯片技術像其它高新技術一樣,在在IC平面工藝和平面工藝和MEMS技術的推技術的推動下動下,向集成化方向迅速推進。微米泵、導向閥門、樣品加注通道、向集成化方向迅速推進。微米泵、導向閥門、樣品加注通道、混合室、混合室、PCR反應室、毛細管電泳分離及反應室、毛細管電泳分離及DNA檢測集成在一起不但消除分析檢測集成在一起不但消除分析中人工操作的環(huán)節(jié)中人工操作的環(huán)節(jié),大大加快大大加快DNA分析的速度分析的速度,而且避免了而且避免了PCR產物的產物的傳遞、存儲及其帶來的一系

40、列問題。高集成度的片上實驗室傳遞、存儲及其帶來的一系列問題。高集成度的片上實驗室5（Lab-on-chip, LOC）是）是PCR芯片未來發(fā)展的重要方向之一。芯片未來發(fā)展的重要方向之一。 圖圖1-2 Burns所研制的集成化所研制的集成化PCR芯片示意圖芯片示意圖 2021/3/2354 賓夕法尼亞大學的賓夕法尼亞大學的Mann A. ShoffnerMann A. Shoffner等人報道了類似等人報道了類似結構的結構的PCRPCR芯片芯片, ,采用了標準的微機械加工技術（薄膜生長采用了標準的微機械加工技術（薄膜生長或淀積或淀積, ,光刻、單晶硅各項異性腐蝕、硅光刻、單晶硅各項異性腐蝕、硅-

41、 -玻璃靜電鍵合等）玻璃靜電鍵合等）制作了尺寸為制作了尺寸為14mm14mm17mm17mm的的PCRPCR芯片。玻璃蓋片與單晶硅芯片。玻璃蓋片與單晶硅（上面預先刻蝕了（上面預先刻蝕了115115微米深的腔體）通過靜電鍵合在一微米深的腔體）通過靜電鍵合在一起形成起形成PCRPCR反應室。反應室。PCRPCR反應以空腸彎菌（反應以空腸彎菌（Campylobacter Campylobacter jejunijejuni）DANDAN為模板為模板, ,對對1212微升的反應液進行熱循環(huán)。為了微升的反應液進行熱循環(huán)。為了考察反應室內表面鈍化層對考察反應室內表面鈍化層對PCRPCR的影響的影響, ,他

42、們對反應室內表他們對反應室內表面作了各種化學修飾（熱生長及化學淀積面作了各種化學修飾（熱生長及化學淀積 SiO2SiO2、Si3N4Si3N4等等薄膜）后進行同樣條件的薄膜）后進行同樣條件的PCRPCR反應反應, ,并且與傳統(tǒng)并且與傳統(tǒng)PCRPCR結果進結果進行了比較。結果表明行了比較。結果表明, ,單晶硅及氮化硅對單晶硅及氮化硅對PCRPCR都有大的抑制都有大的抑制作用作用, ,經二氧化硅修飾的經二氧化硅修飾的PCRPCR芯片可取得與傳統(tǒng)毛細芯片可取得與傳統(tǒng)毛細PCRPCR管管同樣的擴增效果。同樣的擴增效果。2021/3/2355 芯片由單晶硅片與玻璃構成（如圖芯片由單晶硅片與玻璃構成（如圖

43、1-11-1所示）。采用了熱所示）。采用了熱生長、化學氣象淀積、光刻、腐蝕等普通的生長、化學氣象淀積、光刻、腐蝕等普通的ICIC平面工藝技平面工藝技術術, ,在單晶硅上腐蝕了在單晶硅上腐蝕了10mmX10mmX0.5mm10mmX10mmX0.5mm的腔的腔, ,與玻璃片通與玻璃片通過硅橡膠密封過硅橡膠密封, ,形成形成PCRPCR反應室反應室, ,并且封入了并且封入了1mm1mm聚乙烯導入聚乙烯導入/ /導出管導出管, ,用于反應物的加注及導出。淀積用于反應物的加注及導出。淀積25002500埃的多晶硅埃的多晶硅作為反應室底部加熱源。反應室內部溫度的測量元件由作為反應室底部加熱源。反應室內部

44、溫度的測量元件由Cr/AlCr/Al構成構成, ,芯片內反應室容積芯片內反應室容積5050微升。對反應室加樣后進微升。對反應室加樣后進行溫度循環(huán)試驗。溫度控制精度為行溫度循環(huán)試驗。溫度控制精度為+/-1.5+/-1.5, ,在主動加熱、在主動加熱、被動冷卻下（被動冷卻下（9494到到5555, ,環(huán)境溫度為環(huán)境溫度為2525）升溫及降溫）升溫及降溫速度可達速度可達15/S15/S。對于。對于2525微升的反應室其最大升降溫速度微升的反應室其最大升降溫速度可達可達35/S35/S。2021/3/2356Burns所研制的集成化PCR芯片示意 圖 納升級DNA分析芯片2021/3/2357 2 P

45、CR2 PCR循環(huán)循環(huán) PCRPCR的主要內容就是重復性的循環(huán)的主要內容就是重復性的循環(huán), ,其中每一循環(huán)包括三個基其中每一循環(huán)包括三個基本步驟本步驟: :高溫下雙鏈高溫下雙鏈DNADNA變性解鏈變性解鏈, ,需要在需要在9494以上保溫以上保溫1-21-2分鐘分鐘; ;低溫下寡核苷酸引物與單鏈模板配對退火或雜交低溫下寡核苷酸引物與單鏈模板配對退火或雜交, ,需要在需要在50-55 50-55 保溫保溫1-21-2分鐘分鐘, ,在酶催化下由引物延伸在酶催化下由引物延伸, ,合成完整的目的片段拷合成完整的目的片段拷貝貝, ,該拷貝又可作為下一循環(huán)的模板。該過程需要在該拷貝又可作為下一循環(huán)的模板。

46、該過程需要在72 72 保溫保溫1-21-2分鐘。引物的分鐘。引物的33端必須與目的片段精確互補端必須與目的片段精確互補, ,而而55端可以是端可以是非互補性的尾巴非互補性的尾巴, ,通常是內切酶位點序列或啟動子序列通常是內切酶位點序列或啟動子序列, ,在在PCRPCR中中同樣被合成。隨著循環(huán)的進行同樣被合成。隨著循環(huán)的進行, ,原來的模板和新合成的目的片段原來的模板和新合成的目的片段均作為底物參與變性、退火、延伸等反應。理論上講（即假定擴均作為底物參與變性、退火、延伸等反應。理論上講（即假定擴增效率為增效率為100%100%）, ,每一輪循環(huán)結束以后每一輪循環(huán)結束以后, ,目的片段的數(shù)量要增

47、加一目的片段的數(shù)量要增加一倍倍, ,即呈幾何級數(shù)增加。上面已經假定即呈幾何級數(shù)增加。上面已經假定, ,三步循環(huán)中的每一步都有三步循環(huán)中的每一步都有最短的有效反應時間最短的有效反應時間, ,而每一步反應的時間太長則不僅浪費而每一步反應的時間太長則不僅浪費, ,而且而且不利于不利于DNADNA聚合酶的活性。另一方面聚合酶的活性。另一方面, ,至少是相對較短的至少是相對較短的DNADNA片段片段（100-200bp100-200bp長）長）, ,兩步兩步PCRPCR（94 94 變性一分鐘變性一分鐘50-57 50-57 引物雜引物雜交交/ /延伸一分鐘）能延伸一分鐘）能 產生與三步產生與三步PCR

48、PCR同樣多的產物。這可能是由同樣多的產物。這可能是由于于TaqTaq聚合酶有很高的持續(xù)合成能力聚合酶有很高的持續(xù)合成能力, ,反應混合物在反應混合物在50-94 50-94 之間之間過渡時達到過渡時達到TaqTaq聚合酶最佳反應溫度（聚合酶最佳反應溫度（70-75 70-75 ）, ,在這么短的在這么短的時間內與模板退火的引物完全伸展。時間內與模板退火的引物完全伸展。2021/3/2358 這一點與快速這一點與快速PCRPCR的結果是一致的（的結果是一致的（Wittwer & Garling Wittwer & Garling 19911991）。在提高溫度循環(huán)速度（降低坡道

49、時間）的嘗試中）。在提高溫度循環(huán)速度（降低坡道時間）的嘗試中, ,研究人員采用毛細管作為研究人員采用毛細管作為PCRPCR反應容器反應容器, ,以空氣作為熱傳導以空氣作為熱傳導介質。用微量離心管完成介質。用微量離心管完成3030個循環(huán)的標準程序需要個循環(huán)的標準程序需要2-62-6小小時。而文獻報道用快速循環(huán)儀在時。而文獻報道用快速循環(huán)儀在1515分鐘內完成了三步分鐘內完成了三步PCRPCR的的3535個循環(huán)?？焖賯€循環(huán)。快速PCRPCR每一個循環(huán)包括每一個循環(huán)包括94 oC94 oC變性不超過一變性不超過一秒、秒、55 oC55 oC退火不超過一秒、退火不超過一秒、72 oC72 oC延伸十秒

50、鐘。除了縮短延伸十秒鐘。除了縮短循環(huán)時間外循環(huán)時間外, ,快循環(huán)快循環(huán)PCRPCR擴增比用傳統(tǒng)熱循環(huán)儀完成的三步擴增比用傳統(tǒng)熱循環(huán)儀完成的三步PCRPCR更特異。目前快速更特異。目前快速PCRPCR可能限制是反映體積?。赡芟拗剖欠从丑w積?。?0ul10ul）。）。由于體積限制只能用由于體積限制只能用50ng DNA50ng DNA作為模板。另外作為模板。另外, ,快速快速PCRPCR可可以有效的用于分析第一復雜度基因組（細菌以有效的用于分析第一復雜度基因組（細菌, ,質?；蚴删|粒或噬菌體）和（或）均一群體。同時體）和（或）均一群體。同時, ,快速快速PCRPCR產物與熱傳統(tǒng)產物與熱傳統(tǒng)PC

51、RPCR（1X1012-5X1012 1X1012-5X1012 拷貝）一樣多?？截悾┮粯佣?。 像標準像標準PCRPCR緩沖列一樣緩沖列一樣, ,標準的三步標準的三步PCRPCR方式也因被視作被方式也因被視作被進一步改進的工作點。通常提高退火溫度和延伸時間可以進一步改進的工作點。通常提高退火溫度和延伸時間可以提高提高PCRPCR的特異性。同樣的特異性。同樣, ,在擴增大片段（大于在擴增大片段（大于1kb1kb）時有）時有必要延長每一步的時間以得到充分的擴增。必要延長每一步的時間以得到充分的擴增。 2021/3/2359 3 PCR3 PCR的特異性、效率和忠實性的特異性、效率和忠實性 特異性、

52、有效性和忠實性是檢驗特異性、有效性和忠實性是檢驗PCRPCR擴增效率擴增效率55的三個指標。高度特異的的三個指標。高度特異的PCRPCR反應只產生一個反應只產生一個擴增產物擴增產物, ,即預期的靶序列。擴增反應越有效即預期的靶序列。擴增反應越有效, ,經經過相對少的循環(huán)會產生更多的產物。一個非常精過相對少的循環(huán)會產生更多的產物。一個非常精確的確的PCRPCR反應產物中由反應產物中由DNADNA聚合酶誘導的錯配是可聚合酶誘導的錯配是可以忽略不計的。理想的以忽略不計的。理想的PCRPCR反應應該是特異、高效、反應應該是特異、高效、忠實的。研究表明這三個參數(shù)中的每一個都受忠實的。研究表明這三個參數(shù)中

53、的每一個都受PCRPCR反應的眾多成分所影響反應的眾多成分所影響, ,包括緩沖條件、包括緩沖條件、PCRPCR循環(huán)循環(huán)方式（溫度和每一步的持續(xù)時間）以及方式（溫度和每一步的持續(xù)時間）以及DNADNA聚合酶。聚合酶。遺憾的是遺憾的是, ,高特異的反應條件可能與高產量的反應高特異的反應條件可能與高產量的反應條件并不一致。同樣地條件并不一致。同樣地, ,高保真也可能導致低產率。高保真也可能導致低產率。因此因此, ,建立建立PCRPCR反應時反應時, ,必須清楚哪一個參數(shù)對預期必須清楚哪一個參數(shù)對預期的擴增是最重要的的擴增是最重要的, ,據此優(yōu)化反應條件。據此優(yōu)化反應條件。 2021/3/2360連續(xù)

54、流連續(xù)流PCR芯片的結構設計芯片的結構設計PCRPCR反應效率與反應室的比表面（表面積反應效率與反應室的比表面（表面積/ /體積比）有直接體積比）有直接的關系。為了得到高比表面的反應室的關系。為了得到高比表面的反應室, ,圖圖2-32-3所示的芯片結所示的芯片結構是一種熱板保溫式的連續(xù)流微通道構是一種熱板保溫式的連續(xù)流微通道PCRPCR芯片芯片77。在。在50mm50mm30mm30mm1mm1mm的硅片上刻蝕出的硅片上刻蝕出9090微米寬微米寬, ,4040微米深的微微米深的微溝道溝道, ,與另一塊同樣尺寸的上蓋片玻璃鍵合在一起形成微通與另一塊同樣尺寸的上蓋片玻璃鍵合在一起形成微通道反應室。

55、道反應室。 A 950C 解鏈解鏈B 770C 延伸延伸C 600C 退火退火 CABAAA2021/3/2361 解鏈、退火和引伸的溫度依次為解鏈、退火和引伸的溫度依次為950C950C、600C600C和和770C770C。三個。三個功能區(qū)的恒定溫度由熱板提供并保持。三個區(qū)域（解鏈、功能區(qū)的恒定溫度由熱板提供并保持。三個區(qū)域（解鏈、退火和引伸）的時間比為退火和引伸）的時間比為4:4:94:4:9, ,相應地反應液在三個區(qū)域相應地反應液在三個區(qū)域流經的路程比為流經的路程比為4:4:94:4:9（液體的流動速度一樣）。但是由（液體的流動速度一樣）。但是由于反應需要于反應需要, ,我們將延伸區(qū)設

56、計在芯片的中間我們將延伸區(qū)設計在芯片的中間, ,而該過程反而該過程反應時間又是最長的應時間又是最長的, ,如果再將整個區(qū)域建成一條直通道如果再將整個區(qū)域建成一條直通道, ,那那么芯片的整體尺寸將大大增加。所以為了減小芯片的長度么芯片的整體尺寸將大大增加。所以為了減小芯片的長度, ,我們將延伸區(qū)設計多流一個來回我們將延伸區(qū)設計多流一個來回, ,以略增加芯片寬度來將以略增加芯片寬度來將中間區(qū)域的長度減小為原來的中間區(qū)域的長度減小為原來的1/31/3。同理。同理, ,退火和解鏈區(qū)域退火和解鏈區(qū)域的寬度也應為其實長的的寬度也應為其實長的1/21/2。2021/3/2362 芯片設計的反應以空腸彎曲菌芯片設計的反應以空腸彎曲菌DNADNA為模板為模板, ,采用采用Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶, ,全部反應液體積為全部反應液體積為10ul10ul, ,整個反應完成需要整個反應完成需要2020個循環(huán)。反應液的流速為個循環(huán)。反應液的流速為15.6nl/s15.6nl/s, ,即為即為4.33mm/s4.33mm/s。反。反應液流經除了溫度過渡區(qū)以外的整個芯片所需要的時應液流經除了溫度過渡區(qū)以外的整個芯片所需要的時間為間為4 4分鐘分鐘, ,每個循環(huán)則為每個循環(huán)則為1212秒秒, ,那么按比例可知三個