以生物大分子互作為基礎(chǔ)的基因克隆方法VIP

1、藍(lán)色海洋書(shū)的海洋以生物大分子互作為基礎(chǔ)的基因克隆方法 1酵母雙雜交體系 酵母雙雜交體系主要用于討論蛋白質(zhì)之間的互相作用。該體系用于分析已知蛋白質(zhì)之間的互相作用，或者是用于篩選與已知蛋白質(zhì)互相作用的未知蛋白質(zhì)分子。酵母雙雜交系統(tǒng)的可行性和有用性經(jīng)過(guò)多年的用法已經(jīng)非常完美。酵母雙雜交的基本原理：真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄激活作用是由功能相對(duì)自立的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dna binding domain, bd)和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(transcription activation domain, ad)共同完成的。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域通過(guò)共價(jià)或者非共價(jià)銜接建立的空間聯(lián)系是導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間互相結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵。利用這個(gè)特點(diǎn)

2、，我們就可以舉行蛋白質(zhì)互相作用之間的分析。假定兩個(gè)不同的蛋白質(zhì)分子x和y，它們之間存在互相作用。那么，我們可以將x和y分離與酵母轉(zhuǎn)錄因子的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成融合蛋白質(zhì)，也就是bd-x/ad-y或者bd-y/ad -x。當(dāng)這兩個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(bd-x/ad-y)單獨(dú)存在時(shí)無(wú)轉(zhuǎn)錄激活功能。而當(dāng)兩個(gè)不同的蛋白質(zhì)分子x和y之間存在互相作用、bd/ad兩個(gè)結(jié)構(gòu)域逼近或者共價(jià)結(jié)合時(shí)轉(zhuǎn)錄功能復(fù)原。在通常的狀況下，已知的蛋白質(zhì)x與dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域互相融合形成bd-x融合蛋白，而待檢測(cè)的蛋白質(zhì)y與轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域互相融合形成ad-y, x-bd融合蛋白稱(chēng)為誘餌蛋白(bait protein)，而y-ad融合蛋白稱(chēng)

3、為被誘捕蛋白(prey protein)。含有x, y的蛋白質(zhì)同時(shí)在一個(gè)中表達(dá)，當(dāng)x與y之間能夠發(fā)生互相作用時(shí)，誘餌蛋白和被誘捕蛋白之間能夠在空間上互相逼近，報(bào)告基因得以激活。相反，假如x與y之間沒(méi)有互相作用，誘餌蛋白和被誘捕蛋白質(zhì)之間就不能夠在空間上互相逼近，報(bào)告基因不表達(dá)。按照這個(gè)原理可以便利地檢測(cè)蛋白質(zhì)之間的互相作用。酵母雙雜交系統(tǒng)充分利用了酵母能夠表達(dá)真核生物基因，不需要分別純化蛋白質(zhì)，囫圇過(guò)程只需要對(duì)舉行操作，同時(shí)酵母的生長(zhǎng)速度快、簡(jiǎn)單操作等優(yōu)點(diǎn)，使酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用非常廣泛。常用的酵母雙雜交體系包括以gal4為基礎(chǔ)的體系和以lexa為基礎(chǔ)的雙雜交體系(圖8-10)。圖8-10酵母

4、雙雜交暗示圖a轉(zhuǎn)錄激活暗示圖；b.酵母雙雜交暗示圖。ad表示轉(zhuǎn)錄激活位點(diǎn)；bd表示dna結(jié)合位點(diǎn)；reporter gene為報(bào)告基因酵母雙雜交系統(tǒng)用法的基本步驟如下所述。(1)鑒別已知蛋白質(zhì)之間是否存在互相作用。鑒定兩個(gè)已知蛋白質(zhì)之間是否存在互相作用是酵母雙雜交系統(tǒng)最為有效的辦法。只需要將兩個(gè)待討論的蛋白質(zhì)分離與ad和bd互相融合，同時(shí)轉(zhuǎn)化同一個(gè)，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因是否表達(dá)來(lái)判定x與y之間是否存在互相作用。圖8-11為如何檢測(cè)兩個(gè)蛋白質(zhì)之間是否存在互相作用的流程圖。圖8-11鑒別已知蛋白質(zhì)之間有無(wú)互相作用的流程圖(2)尋覓與某個(gè)蛋白質(zhì)互相作用的未知蛋白質(zhì)。討論蛋白質(zhì)之間的互相作用可以鑒定出與已

5、知蛋白質(zhì)發(fā)生作用的新的蛋白質(zhì)分子。尋覓與目的蛋白質(zhì)互相作用的蛋白質(zhì)時(shí)，首先構(gòu)建含有目的蛋白質(zhì)基因的表達(dá)質(zhì)粒(bd-x)，鑒定bd表達(dá)質(zhì)粒的自轉(zhuǎn)錄活性。假如蛋白質(zhì)x沒(méi)有自轉(zhuǎn)錄活性，那么bd-x就可以用于酵母雙雜交的篩選。然后，將待分析的cdna克隆到ad表達(dá)質(zhì)粒中構(gòu)建酵母雙雜交的cdna文庫(kù)(ad-cdna)，將表達(dá)的質(zhì)粒和雜交的文庫(kù)共同轉(zhuǎn)化，獲得表達(dá)的陽(yáng)性克隆。抽提ad表達(dá)質(zhì)粒并對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒的插入片段舉行測(cè)序。測(cè)序完成以后，逐一分析所得到的候選蛋白與y蛋白之間作用的真切性。假如的確存在互相作用，那么就可以初步認(rèn)定兩個(gè)蛋白質(zhì)之間為互作蛋白。結(jié)合分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的手段，我們可以最后找到蛋白質(zhì)x的互

6、作蛋白。這個(gè)分析過(guò)程8-12所示。2噬菌體展示技術(shù)噬菌體展示技術(shù)是g. p. smith等于1985年提出來(lái)的一種利用蛋白質(zhì)互相作用的體外免疫系統(tǒng)，它能夠?qū)⒒蚱闻c蛋白質(zhì)分子有效地聯(lián)系在一起。噬菌體展示技術(shù)的基本原理是，當(dāng)外源dna片段分子插入到絲狀噬菌體基因組中的一個(gè)外被蛋白質(zhì)基因中時(shí)，假如兩者的讀碼框架保持全都時(shí)，外源片段的dna分子所編碼的產(chǎn)物可以與外包被蛋白質(zhì)一起形成一個(gè)融合蛋白質(zhì)，這個(gè)融合蛋白質(zhì)可以顯示在噬菌體的表面。利用抗此外源基因編碼產(chǎn)物的抗體，通過(guò)抗原一抗體的親和作用，就能夠從大量噬菌體中分別出含有所要基因的融合噬菌體。然后，通過(guò)基因擴(kuò)增就可以得到大量所要的目的基因片段。圖8

7、-12尋覓與某個(gè)已知蛋白質(zhì)互相作用的蛋白質(zhì)噬菌體展示技術(shù)的基本過(guò)程如下所述。(1)構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)。構(gòu)建一個(gè)大容量的噬菌體庫(kù)是噬菌體展示技術(shù)的關(guān)鍵所在。通常用于構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)的噬菌體包括兩種不同的類(lèi)型。一種是以m13, fl, fd等為載體的抗體庫(kù)；另一種是以上述噬菌體的復(fù)制起始序列為基礎(chǔ)組建的噬菌體質(zhì)粒載體(phagemid)。絲狀噬菌體的外被蛋白基因班和基因珊是常用的與外源dna序列一起產(chǎn)生融合蛋白的基因?；蚓幋a由406個(gè)氨基酸組成的p3蛋白，每個(gè)噬菌體由35個(gè)不同p3蛋白組成，位于絲狀噬菌體的一端。基因編碼50個(gè)組成的p8蛋白，每個(gè)噬菌體上大約有2700個(gè)p8蛋白質(zhì)分子。這兩種不同蛋

8、白質(zhì)的共同點(diǎn)是蛋白質(zhì)的n端位于噬菌體的外部，而c端位于噬菌體的內(nèi)部。當(dāng)外源dna片段與這兩個(gè)基因互相融合時(shí)蛋白質(zhì)的片段裸露在噬菌體的表面。對(duì)實(shí)際用法而言，討論者更偏向用法噬菌體質(zhì)粒載體作為構(gòu)建抗體庫(kù)的載體，因?yàn)槭删w質(zhì)粒載體既有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)又有噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)，非常簡(jiǎn)單操作并且轉(zhuǎn)化效率比較高?？贵w庫(kù)的構(gòu)建：首先利用限制性?xún)?nèi)切將噬菌體質(zhì)粒載體酶切，然后與待分析組織的cdna分子舉行銜接，銜接以后的dna分子挺直轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化以后的大腸桿菌在協(xié)助噬菌體(helper phage)的作用下，噬菌體質(zhì)粒被包裝，然后通過(guò)噬菌體的獲救辦法構(gòu)建成為噬菌體抗體庫(kù)。一個(gè)比較典型的噬菌體抗體庫(kù)的容量

9、通常在109個(gè)以上。隨著抗體庫(kù)容量的增強(qiáng)，篩選到特異性抗體片段的可能性就越大。(2)從噬菌體庫(kù)中篩選特異抗體。噬菌體抗體庫(kù)構(gòu)建完成以后，下一步的工作就是從抗體庫(kù)中篩選特異的抗體?？贵w篩選的基本原則是親和捕捉。首先將抗原包被在固相物質(zhì)的表面，如384孔的微孔板上，然后加入噬菌體抗體庫(kù)與抗原舉行溫育。溫育一段時(shí)光以后，將微孔板放入緩沖液中舉行淘洗。經(jīng)過(guò)淘洗以后，表面留下那些能夠與目標(biāo)抗原相結(jié)合的抗體噬菌體。親和捕捉辦法的篩選效率高，特異性比較強(qiáng)，能夠從109個(gè)以上克隆的抗體庫(kù)中篩選獲得一個(gè)特異性的目的基因。(3)陽(yáng)性抗體克隆的dna序列分析。因?yàn)榻?jīng)過(guò)一次親和捕捉的噬菌體有多個(gè)，因此親和捕捉以后的噬菌體舉行繁殖，再次感染。這些再次感染的大腸桿菌又可以形成一個(gè)小型的富集的噬菌體抗體庫(kù)。這個(gè)小型的噬菌體抗體庫(kù)再次重復(fù)以上的篩選過(guò)程直到獲得少量的克隆為止。(4) dna序列的分析和驗(yàn)證。將這些有高度親和能力的噬菌體舉行回收。通過(guò)質(zhì)粒獲救的辦法就能夠?qū)⑼庠吹钠畏謩e出來(lái)。通過(guò)測(cè)序就能夠獲得基因的所有序列。(5)基因功能的鑒定。通過(guò)突變?nèi)笔мk法進(jìn)一步分析基因功能。除了上述的一些基因克隆辦法以外，隨著基因組技術(shù)的進(jìn)展，利用生物信息學(xué)手段來(lái)協(xié)助和尋覓新的基因是一種重要手段。因?yàn)樵絹?lái)越多基因組的全序列被測(cè)定，隨著功能基因組討論和后功能基因組討論時(shí)代的到來(lái)，基因克隆與分別在技術(shù)上已經(jīng)不存在大的障礙。普通