ELISA檢測溶血素

1、【試劑與器材】 綿羊紅細胞（SRBC）免疫小鼠血清 抗SRBC陽性和陰性血清 辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗甲胎蛋白抗體 碳酸鹽緩沖液（PH9.6） 磷酸鹽緩沖液（PBS，PH7.4） 鄰笨二胺液 硫酸（2M） 酶標(biāo)反應(yīng)板、微量加樣器、溫箱、冰箱、酶標(biāo)儀等?！驹噭┡c器材】 包被稀釋液（0.05mol/L Na2CO3NaHCO3 緩沖液，PH9.6） Na2CO3 1.5g NaHCO3 2.9g 加雙蒸水至1000ml 封閉液（5%小牛血清/PBS 溶液） 小牛血清50ml PBS（PH7.4）950ml 洗滌液（PBST，PH7.4） NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2H

2、PO4.12H2O 2.9g KCl 0.2g Tween 20 0.5ml 加雙蒸水至1000ml【試劑與器材】 樣本稀釋液（PBS，PH7.4） NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO4.12H2O 2.9g KCl 0.2g 加雙蒸水至1000ml 酶標(biāo)第二抗體：羊抗人IgG 標(biāo)記HRP（1：2000）【試劑與器材】 底物液（OPDH2O2） A 液 （0.1mol/L 檸檬酸溶液） 檸檬酸19.2g 加雙蒸水至1000ml B 液 （0.2mol/L Na2HPO4 溶液） Na2HPO4.12H2O 71.7g 加雙蒸水1000ml 臨用前取A 液24.3ml，B

3、液25.7ml 終止液（2mol/LH2SO4 溶液） 雙蒸水600ml，濃硫酸100ml（緩慢滴加并不斷攪拌），加雙蒸水至900ml【操作方法】（1）包被酶標(biāo)反應(yīng)板 用pH9.6 的碳酸鹽緩沖液1：200 稀釋抗體，用之包被聚乙烯塑料板，每孔加0.2ml， 4C 1224h。（2）封閉酶標(biāo)反應(yīng)板 棄掉包被液，用PBS 洗滌3 次，甩干后用5%小牛血清/PBS 液封閉。放37C40min（或4C 過夜）。封閉結(jié)束后用洗滌液洗板，并在濾紙上拍干，每孔洗3遍，每遍3min。ELISA平板包被間接法 抗原包被: 將包被液稀釋的抗原（SRBC）BSA （2-10ug/ml）加入96孔酶標(biāo)版中，每孔10

4、0ul，4C過夜。吸出上清液，加入封閉液200ul/孔。37C封閉1-1.5小時或4C過夜。封閉結(jié)束后用洗滌液洗板3次，每次3分鐘?！静僮鞣椒ā浚?）按圖1-11 所示加入待測樣品及陽性對照（用PBS 稀釋） 將稀釋好的待測血清樣品加入酶標(biāo)反應(yīng)板中，每孔0.2ml，陽性對照樣品亦相應(yīng)稀釋。置于37C 溫箱0.51h。棄去孔中液體，用洗滌液洗滌3 遍，每遍3min。（4）加酶標(biāo)二抗 （用PBS 稀釋） 加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗甲胎蛋抗體，每孔0.2ml 置于37C 溫箱，3045 min。棄去孔中液體，拍干，每孔洗滌3 遍，每遍3min?！静僮鞣椒ā浚?）加入底物液 取底物液：A 液24.3m

5、l，B 液25.7ml，加雙蒸水50ml 得pH5.0 的磷酸枸緣酸緩沖液100ml。再加入鄰苯二胺40mg，充分溶解，最后加入30% H2O2 0.15ml。每孔加入底物液100l。避光室溫作用510min。（6）終止反應(yīng) 當(dāng)陽性對照出現(xiàn)明顯顏色變化后，每孔加入終止液50l 終止反應(yīng)?！窘Y(jié)果分析】目測：根據(jù)顯色深淺，用（-）為無色，（+）為淺色，（+）為黃色，（+ + +）為棕黃色表示。一般呈+ +以上者為陽性酶標(biāo)儀測定：在492nm 波長下測OD 值（A492） 。 當(dāng)待測樣品A492值與陰性對照A492值的比值（P/N）大于2.1時，或待測樣品A492對照A492值 +3s，即可判斷為陽

6、性。以最大顯色至陽性顯色孔的50%反應(yīng)孔的抗體稀釋倍數(shù)為抗體效價。x【注意事項】1.封閉時注意將封閉液加滿各反應(yīng)孔，并去除各孔中可能產(chǎn)生的貼孔壁氣泡。2.加洗滌液時，每孔加滿，但不要溢出。3.每次洗滌液在孔中的停留時間不應(yīng)少于1 分鐘。4.洗滌后板要甩干，不要殘留液體。感謝您的瀏覽 相關(guān)幫助 需要相關(guān)抗體試劑的可以訪問Fantibody全球抗體搜索引擎 fantibody全球抗體搜索引擎是一個供公共檢索的抗體數(shù)據(jù)庫，其抗體信息數(shù)據(jù)來源于全球范圍的研究機構(gòu)與商業(yè)公司。該引擎由商品化抗體數(shù)據(jù)庫與抗體應(yīng)用評價數(shù)據(jù)庫兩部分組成，以幫助研究者更高效的尋找并評估該抗體的性能。全球抗體搜索引擎是繼基因與蛋白

7、數(shù)據(jù)庫之后更為復(fù)雜的應(yīng)用型檢索平臺 需要相關(guān)的實驗室儀器設(shè)備、生物試劑、醫(yī)療器械、制藥設(shè)備、醫(yī)藥原料、體外診斷試劑及耗材與技術(shù)服務(wù)信息的，可以訪問探生網(wǎng)biomean進行咨詢，期待您的加入【試劑與器材】 樣本稀釋液（PBS，PH7.4） NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO4.12H2O 2.9g KCl 0.2g 加雙蒸水至1000ml 酶標(biāo)第二抗體：羊抗人IgG 標(biāo)記HRP（1：2000）ELISA平板包被間接法 抗原包被: 將包被液稀釋的抗原（SRBC）BSA （2-10ug/ml）加入96孔酶標(biāo)版中，每孔100ul，4C過夜。吸出上清液，加入封閉液200ul/孔。37C封閉1-1.5小時或4C過夜。封閉結(jié)束后用洗滌液洗板3次，每次3分鐘。【結(jié)果分析】目測：根據(jù)顯色深淺，用（-）為無色，（+）為淺色，（+）為黃色，（+ + +）為棕黃色表示。一般呈+ +以上者為陽性酶標(biāo)儀測定：在492