experiment土壤細菌的分離及純化

1、 一 、目的要求1.通過從土壤中分離純化細菌，掌握培養(yǎng)基的制備與滅菌技術(shù)、微生物的分離純化方法和無菌操作技術(shù)。2.掌握微生物的鑒定技術(shù)第一部分培養(yǎng)基的配制與滅菌一、實驗目的 1.學習配制培養(yǎng)基的原理，并掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。 2.學習幾種常用培養(yǎng)基的配制、分裝和滅菌的操作方法. 3.進一步熟練掌握高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法。二、實驗原理（1） 培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。在自然界中，微生物種類繁多，營養(yǎng)類型多樣，加之實驗和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多。但是，不同種類的培養(yǎng)基中，一般應(yīng)含有水分、

2、碳源、氮源、能源、無機鹽、生長因素等。不同微生物對 pH 要求不一樣，霉菌和酵母的培養(yǎng)基的 pH 一般是偏酸性的，而細菌和放線菌的培養(yǎng)基的 pH 一般為中性或微堿性的 ( 嗜堿細菌和嗜酸細菌例外 ) 。所以配制培養(yǎng)基時，都要根據(jù)不同微生物的要求將培養(yǎng)基的 pH 調(diào)到合適的范圍。 此外，由于配制培養(yǎng)的各類營養(yǎng)物質(zhì)和容器等含有各種微生物，因此，已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌，如果來不及滅菌，應(yīng)暫存冰箱內(nèi)，以防止其中的微生物生長繁殖而消耗養(yǎng)分和改變培養(yǎng)的酸堿度所帶來不利的影響。 二、實驗原理（2） 根據(jù)微生物的種類和實驗目的不同，培養(yǎng)基的類別如下： 按成分的不同：天然培養(yǎng)基 、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基

3、 。 按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。 按培養(yǎng)基的用途分：基礎(chǔ)培養(yǎng)基 、營養(yǎng)培養(yǎng)基（加富培養(yǎng)基）、鑒別培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基 。 二、實驗原理（3） 目前已有各種商品化的“干燥培養(yǎng)基”成品出售。這種培養(yǎng)基是將新鮮配制的液體培養(yǎng)基用噴霧干燥法、真空干燥法、低溫干燥法或蒸發(fā)干燥法等將培養(yǎng)基內(nèi)所含的水分去掉；或?qū)⑴囵B(yǎng)基內(nèi)的各種固形成分，經(jīng)適當處理、充分混勻，便成干燥粉末而成。使用時只要按比例加入一定量的水，經(jīng)溶解、分裝，高壓蒸氣滅菌，即可使用。這種培養(yǎng)基的優(yōu)點是配制省時，攜帶方便，使用簡易，質(zhì)量穩(wěn)定。 三、實驗器材 1.藥品及試劑：根據(jù)所要制備的培養(yǎng)基準備所需試劑。 2.儀器

4、及其它：試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻棒、天平、藥匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙(5.5-9.0) 、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、干燥箱、培養(yǎng)皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻璃珠、pH試紙等 四、實驗步驟培養(yǎng)基的制備與分裝1.稱量：按培養(yǎng)基配方比例依次準確地稱取藥品。2.熔化：在沸水浴鍋中或電爐上加熱熔化。3.調(diào)pH ：用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)pH至培養(yǎng)基所需pH。4.過濾：趁熱用多層紗布過濾（根據(jù)實際情況確定是否過濾）5.分裝：將溶化的固體培養(yǎng)基趁熱加至漏斗上，裝試管時，注意管口不要沾上培養(yǎng)基。液體分裝裝量不超過試管的1/4，固體分裝裝量不超過試管的1/5，分裝三角瓶的量

5、不超過三角瓶容積的一半，半固體分裝裝量為試管的1/3，滅菌后垂直待凝。6.加棉塞：培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物進入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能，然后包扎一層牛皮紙。試管應(yīng)先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮紙，貼上標簽，注明培養(yǎng)基名稱、日期、組別。四、實驗步驟無菌水的制備1.用量筒量取90ml水于帶玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮紙。2.用10ml吸管取9ml水于試管中，塞上棉塞，包扎牛皮紙。四、實驗步驟器皿的準備1.培養(yǎng)皿的包裝：每10套一包，用舊報紙或牛皮紙包扎（或放在特制鐵皮圓筒里，加蓋扣嚴）。2.吸管的包裝：首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用

6、長紙條包扎、打結(jié)。3.玻璃涂布棒的包裝：方法同吸管的包裝。4.槍尖的包裝：放入槍尖盒，牛皮紙包裝。四、實驗步驟高壓滅菌1.將所要滅菌物品放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，根據(jù)需要設(shè)定滅菌溫度和時間（一般121，20min滅菌，若培養(yǎng)基中含有葡萄糖等成分時，113 ，30min滅菌）。如因特殊情況不能及時滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。2.滅菌完畢，將試管培養(yǎng)基擱成斜面，擱置的斜面長度以不超過試管總長度的一半為宜。培養(yǎng)基冷至50左右，倒平板。3.將滅菌的培養(yǎng)基放入37的溫室中培養(yǎng)2448h，以檢查滅菌是否徹底。五、思考題 1.培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng)菌是無菌的？ 2.加壓蒸汽滅菌的原

7、理是什么？是否只要壓力表上的指針指到所需的壓力時就能達到所需滅菌溫度？為什么？第二部分微生物的分離與純化一、目的要求1.通過從土壤中分離純化細菌，掌握微生物的分離純化方法和無菌操作技術(shù)。2.初步掌握微生物的菌種保藏技術(shù)。 二、實驗原理（1）1.自然界中各種微生物混雜生活在一起，要研究某種微生物的特性，首先須使該微生物處于純培養(yǎng)狀態(tài)。從混雜的微生物群體中獲得只含有某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。2.土壤是微生物生活的大本營，可以從中分離到很多有價值的菌株。本實驗將采用平板劃線分離法。三、實驗器材1.土樣2.培養(yǎng)基3.無菌的培養(yǎng)皿、三角瓶、水、玻璃珠、玻璃刮刀、吸管、槍尖等四、操作步驟（

8、1）1.制備土壤稀釋液2.涂布平板3.培養(yǎng)4.挑菌落5.平板劃線分離6.菌種保藏（留作鑒定）四 操作步驟（2）1制備土壤稀釋液 四、操作步驟（3） 挑菌落接種和分離工具1接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀 四、操作步驟（4）四、操作步驟（4）劃線接種點接種穿刺接種涂布接種液體接種注射接種四、操作步驟（5）斜面接種時的無菌操作(1)接種滅菌 (2)開啟棉塞 (3)管口滅菌 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞 四、操作步驟（6）四、操作步驟（7）平板劃線法 平板劃線分離的方法1.斜線法 2.曲線法 3.方格法 4.放射法 5.四格法四、操

9、作步驟（8）平板劃線法 制備土壤稀釋液時，要注意使土樣均勻分散在稀釋液中。 注意無菌操作。五 注意事項 六 思考題 試擬出從土壤中分離芽孢桿菌的主要實驗步驟。 如何檢驗平板上某個單菌落是不是純培養(yǎng)？第三部分 分離菌株的鑒定一、目的要求 掌握常用的微生物鑒定方法。 掌握生理生化試驗的原理與方法。 復習以前學過的各種染色方法二、實驗原理1、微生物的分類鑒定是微生物的重要內(nèi)容，一般從菌落特征、細菌特點及生理生化、分子生物學等方面進行鑒定。2、各種細菌在代謝類型上表現(xiàn)了很大的差異。不同的細菌分解大分子碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪的能力不同，所能發(fā)酵的類型和最終產(chǎn)物也不一樣。不同細菌對營養(yǎng)的要求不同也說明了

10、它們有不同的合成能力。所有這些都反映了它們是有不同的酶系統(tǒng)。細菌的這種生化反應(yīng)的多樣性在自然界產(chǎn)生了兩種結(jié)果：第一、使自然界所有的有機分子都有可能得到分解；第二、使不同細菌之間有了互相作用和互相依賴的基礎(chǔ)，例如，一種微生物能利用另一種微生物所分解的產(chǎn)物。另一方面，微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一,細菌的生化反應(yīng)的多樣性也被人們作為細菌的鑒定和分類方法來利用，可以鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。 三、實驗器材 1試劑：各種染色液、生理生化用試劑等 2微生物材料：學生自己分離純化的菌種 3 其他器材：生理生化培養(yǎng)基、接種環(huán)、培養(yǎng)箱等四、操作步驟（1） 記錄菌種的培養(yǎng)特征 革

11、蘭氏染色，記錄菌體特征與染色特性 芽孢染色 鞭毛染色 查伯杰氏手冊，初步對菌種進行鑒定。四、操作步驟（2） 做以下基礎(chǔ)實驗： 一、糖酵解試驗 二、淀粉水解試驗 三：V-P試驗 四：甲基紅（Methyl Red）試驗 然后根據(jù)學生自己前期對菌種的初步判定結(jié)果，有針對性地加2-3個生理生化實驗進一步鑒定。五、實驗報告 根據(jù)論文發(fā)表格式，寫一篇研究性論文。一、實驗目的 1.學習配制培養(yǎng)基的原理，并掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。 2.學習幾種常用培養(yǎng)基的配制、分裝和滅菌的操作方法. 3.進一步熟練掌握高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法。第二部分微生物的分離與純化 二、實驗原理（1）1.自然界中各種微生物混雜生活在一起，要研究某種微生物的特性，首先須使該微生物處于純培養(yǎng)狀態(tài)。從混雜的微生物群體中獲得只含有某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。2.土壤是微生物生活的大本營，可以從