分子生物學考試資料

1、第一二章遺傳物質(zhì)的分子本質(zhì)基因工程:分、切、接、轉(zhuǎn)、篩遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)：肺炎雙球菌的體內(nèi)轉(zhuǎn)化實驗（格里菲斯）（a）將光滑型肺炎雙球菌注入小鼠體內(nèi)，使小鼠致死。（b）將粗糙型肺炎雙球菌注入小鼠體內(nèi)，對小鼠無害。（c）將光滑型肺炎雙球菌加熱殺死后，再注入小鼠體內(nèi)，對小鼠無害。（d）將加熱殺死的光滑型肺炎雙球菌與粗糙型肺炎雙球菌一起注入小鼠體內(nèi)，小鼠死掉。結論：加熱殺死的S型細菌中，含有某種促成R型細菌轉(zhuǎn)化為S型細菌的“轉(zhuǎn)化因子”肺炎雙球菌的體外轉(zhuǎn)化實驗艾弗里及同事取S型細菌，分離出其中的DNA，蛋白質(zhì)，多糖以及將DNA與DNA酶混合，將以上四組分分別于R型細菌培養(yǎng)基混合培養(yǎng)；結果除有DNA組的培養(yǎng)液

2、中既能分離出R型細菌又能分離出S型細菌，其余各組均只有R型細菌。結論：只有DNA才是使R型細菌產(chǎn)生穩(wěn)定遺傳變化的物質(zhì)。DNA作為遺傳物質(zhì)的證實：噬菌體侵染細胞的實驗用放射性同位素35S標記蛋白質(zhì)，32P標記DNA，用標記的噬菌體感染細菌，發(fā)現(xiàn)只有標記的DNA進入細菌細胞內(nèi)，而標記的蛋白質(zhì)留在細胞外。結論：DNA是遺傳物質(zhì)。證明DNA的半保留復制將大腸桿菌放在15N為唯一氮源的培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)，使細胞內(nèi)的DNA兩條鏈上的14N被15N取代，收集菌體，一部分用于抽取DNA，一部分放在14N為氮源的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)一代，一部分提取DNA，另一部分繼續(xù)培養(yǎng)，再提取DNA,用CsCl密度梯度離心的方法，

3、發(fā)現(xiàn)0代為一條高密度帶，兩條鏈上的N原子全部是15N，第一代為中密度帶，第二代中有中密度帶和低密度兩條帶。DNA的提取：1. 細胞裂解2. 去除蛋白等雜質(zhì)（酚：氯仿：異戊醇25:24:1）3. 沉淀DNA（乙醇，異丙醇）4. 風干DNA5. 溶解DNA細胞破碎：機械方法：超聲波處理法、研磨法（植物葉）勻漿法（動物組織）； 化學試劑法：用SDS、CTAB（植物組織）； 酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，都可使細胞壁破碎。DNA的測序：Sanger的雙脫氧終止法核酸模板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧堿基存在條件下復制或轉(zhuǎn)錄時，如果在四管反應系統(tǒng)中分別按比例引入四種雙脫氧堿基，只要雙脫氧堿基摻入鏈端，該鏈

4、就停止延長，鏈端摻入單脫氧堿基的片段可繼續(xù)延長。如此每管反應體系中便合成以共同引物為5端，以雙脫氧堿基為3端的一系列長度不等的核酸片段。反應終止后，分四個泳道進行電泳。以分離長短不一的核酸片段（長度相鄰者僅差一個堿基），根據(jù)片段3端的雙脫氧堿基，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。PCR技術（聚合酶鏈式反應）原理：雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。反應條件：Taq酶，dNTP,Mg離子，引物，模板過程：變性，退火，延伸核酸的分子雜交（Southern印記雜交）原理：具有互補序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補

5、配對原則退火形成雙鏈的過程。步驟：（一）待測核酸樣品的制備1、 裂解或破碎細胞 2、抽取純化基因組DNA3、限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段（二）待測DNA樣品的電泳分離（三）凝膠中核酸的變性（堿變化）凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的 單鏈 DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液（四）Southern印跡 指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上的過程（五）Southern雜交 1、預雜交：封閉膜上能與DNA結合的位點預雜交液為不含DNA探針的雜交液2、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測DNA雜交雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交3、洗膜：去除游離的放射性探針或

6、非特異結合的DNA（六）雜交結果檢測1、放射自顯影2、比色或化學發(fā)光檢測第三章 基因、基因組及基因組學基因：是DNA分子上具有特定功能的(或具有一定遺傳效應的)核苷酸序列，是遺傳的基本單位。（有編碼序列和非編碼序列兩部分；后者包括調(diào)控序列、內(nèi)含子及編碼區(qū)兩端的序列）轉(zhuǎn)座成分or 移動基因:是一些可以在染色體基因組上從一個位置轉(zhuǎn)移到另一個位置，甚至在不同染色體之間躍遷的DNA成分。有人將之形象地稱為跳躍基因。（Ac/Ds因子）Ac-Ds系統(tǒng) 玉米糊粉層顏色的控制涉及多對相關基因。C基因為野生型時，胚乳呈紫色，若C基因突變?yōu)閏阻斷了紫色素的合成，那么胚乳為白色。在胚乳發(fā)育過程中，若突變發(fā)生回復則導

7、致產(chǎn)生斑點，回復突變發(fā)生得越早，產(chǎn)生的紫斑就越大，發(fā)生得越晚，則產(chǎn)生的紫斑就越小。McClintock認為突變基因c(無色)是由一個可移動的"控制因子(controlling element)"(現(xiàn)稱轉(zhuǎn)座子)引起的，稱為解離因子(dissociator，Ds)，它能合成轉(zhuǎn)座酶，它可以插入到基因C中，即轉(zhuǎn)座。另一個可移動的控制因子是Ac，稱激活因子(Activator)，它的存在可以激活Ds轉(zhuǎn)座進入C基因或別的基因，也能使Ds從基因中轉(zhuǎn)出，使突變基因回復。這就是Ac-Ds系統(tǒng)。斷裂基因：在編碼序列中間插有與氨基酸編碼無關的DNA間隔區(qū)，這些間隔區(qū)稱為內(nèi)含子；而編碼區(qū)則稱為外顯

8、子。含有內(nèi)含子的基因稱為不連續(xù)基因或斷裂基因。（內(nèi)含子并非都含而不顯，外顯子并非都顯）假基因：是一些核苷酸序列與其相應的正常功能基因基本相同、但卻不能合成出功能蛋白質(zhì)的失活基因。（人類珠蛋白）重疊基因：核苷酸序列是彼此重疊的的基因稱為重疊基因或嵌套基因?；虬雌洚a(chǎn)物的功能可分為結構基因、調(diào)控基因和RNA基因。結構基因：可被轉(zhuǎn)錄形成mRNA，并進而翻譯成多肽的基因。調(diào)控基因：指某些可調(diào)節(jié)控制結構基因表達的基因。RNA基因：是一些只轉(zhuǎn)錄不翻譯的基因，包括核糖體RNA基因，專門轉(zhuǎn)錄rRNA；以及tRNA基因，專門轉(zhuǎn)錄tRNA。C值：生物體的單倍體基因組所含DNA總量稱為C值。C值矛盾：生物體的復雜性

9、與DNA含量并不總是正相關。N值矛盾：生物體的復雜性與基因數(shù)之間并不總是正相關。原核生物的基因組包括兩類DNA分子，染色體攜帶細胞生存和繁殖所需的全部遺傳信息，質(zhì)粒染色體以外獨立存在的DNA分子。操縱子(operon)：功能上相關的幾個結構基因前后相連，由一個共同的調(diào)節(jié)基因和一組共同的控制位點，即啟動子(promoter)和操作子(operator)對其表達過程實行協(xié)同調(diào)節(jié)控制。細菌基因表達調(diào)控的這樣一個完整的單元，稱為操縱子。質(zhì)粒DNA：細菌細胞內(nèi)一種自我復制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，能穩(wěn)定地獨立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上?，F(xiàn)在常用的質(zhì)粒大多數(shù)是經(jīng)過改造或人工構建的，

10、常含抗生素抗性基因，是重組DNA技術中重要的工具?；蚣易澹赫婧松锘蚪M中，來源相同、結構相似、功能相關的一組基因。如人類珠蛋白和類珠蛋基因家族。根據(jù)基因家族成員的分布形式不同，基因家族分為：基因簇和散布的基因家族基因簇：基因家族的各成員緊密成簇排列成大段的串聯(lián)重復單位，定位于染色體的特殊區(qū)域。它們是同一個祖先基因擴增的產(chǎn)物。如人類類鏈基因簇和類鏈基因簇。散布的基因家族：基因家族成員在DNA上無明顯的物理聯(lián)系，甚至分散在多條染色體上。如肌動蛋白基因家族和微管蛋白基因家族。重復基因：染色體上大量無轉(zhuǎn)錄活性的重復DNA序列家族，主要是基因以外的DNA序列。重復基因有兩種組織形式：串聯(lián)重復序列和散

11、布的重復序列根據(jù)重復單位的大小，重復基因可分為衛(wèi)星DNA；小衛(wèi)星DNA；微衛(wèi)星DNA 衛(wèi)星DNA：有些高度重復DNA序列的堿基組成和浮力密度同主體DNA有區(qū)別，在浮力密度梯度離心時，可形成不同于主DNA帶的衛(wèi)星帶，此類DNA稱為衛(wèi)星DNA。散布的重復序列：短散布元件（Short interpersed element, SINE；長散布元件（Long interpersed element, LINE）細胞器基因組絕大多數(shù)為環(huán)狀，少數(shù)低等真核生物為線性分子。第四章 DNA的生物合成 DNA復制的基本特點：模板，dNTP, Mg2+，解鏈，半保留復制，需引物，復制方向53，起始特定區(qū)域，終止區(qū)不

12、固定，方向一般為雙向，半不連續(xù)，高度忠實性。與DNA復制有關的酶、蛋白質(zhì)：DNA聚合酶、DNA解鏈酶、單鏈結合蛋白、DNA引發(fā)酶、DNA拓撲異構酶、DNA連接酶和端粒酶。所有DNA聚合酶、 RNA聚合酶的三維結構都相似，由finger、palm、thumb（手指、手掌、拇指）三個結構域組成。原核生物DNA pol E.coli DNA 聚合酶: DNA pol I；DNA pol II；DNA pol III；DNA pol IV；DNA pol V DNA pol I具有53聚合酶活性 5核酸外切酶活性（切除DNA5端的RNA引物） 3核酸外切酶活性（自我校對）Hans Klenow 用蛋白

13、水解酶水解DNA pol I 的323-324位，得到兩個片段：大片段：75kd，605aa聚合酶活性（大）35核酸外切酶活性（?。?；小片段：36kd，323aa 53核酸外切酶活性。DNA聚合酶53外切活性切口平移的功能用于制備探針！DNA pol II有53聚合酶活性 35核酸外切酶活性DNA pol III：多亞基；聚合酶活性是DNA pol I 的 50 倍；50,000base/min；10-20分子/cell；有35 核酸外切酶活性； 無53核酸外切酶活性；高進行性；真核生物DNA pol DNA pol a : 引物合成 DNA pol b : DNA repair DNA po

14、l g : 線粒體 DNA合成 DNA pol d : DNA pol III DNA pol e : DNA pol I半不連續(xù)復制是指DNA復制時，前導鏈上DNA的合成是連續(xù)的，后隨鏈上是不連續(xù)的脈沖標記實驗：以E.coli為材料，在培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中加入同位素3H標記的 dNTP，經(jīng)30秒后，DNA剛開始復制，分離DNA，然后在堿中沉淀，變性，讓新合成的單鏈和模板鏈分開，再用CsCl密度梯度離心，以沉降的快慢來確定片段的大小，再檢測放射標記，結果表明被3H標記的片段，也就是新合成的片段，沉淀系數(shù)為20S左右，即都是長10002000Nt的DNA片段，而親本鏈要比它大2050倍；第二組實驗是

15、脈沖追逐實驗，先進行標記培養(yǎng)30秒，以后除去同位素繼續(xù)培養(yǎng)幾分鐘，再分離DNA在堿中沉淀，檢測結果為較長的片段。剛開始合成的片段都是短片段，以后再連接成長片段。前導鏈上的合成是連續(xù)的，只有后滯鏈上的合成才是半連續(xù)的。端粒：真核細胞內(nèi)線性染色體末端的一種特殊結構，由DNA簡單重復序列以及同這些序列專一性結合的蛋白質(zhì)構成。端粒酶：一種反轉(zhuǎn)錄酶，由蛋白質(zhì)和RNA兩部分組成核糖蛋白復合體，其中RNA是一段模板序列，指導合成端粒DNA的重復序列片段。端粒的功能：穩(wěn)定染色體末端結構，防止染色體間末端連接，并可補償滯后鏈5'末端在消除RNA引物后造成的空缺。DNA復制的高度忠實性（1） 四種脫氧核苷

16、三磷酸濃度的平衡（2） DNApol的高度選擇性（3） DNApol的自我校對（4） 錯配修復（5） 使用RNA作為引物第六章 DNA 重組DNA重組：發(fā)生在DNA分子內(nèi)或分子間核苷酸的交換、重排和轉(zhuǎn)換現(xiàn)象，是已有遺傳物質(zhì)的重新組合。重組的生物學功能:產(chǎn)生新的基因/等位基因的組合（在減數(shù)分裂交換期間）產(chǎn)生新的基因（如抗體基因的重排） 特定的DNA元件的整合DNA修復 重組原理的應用用于染色體上的基因作圖（重組頻率與基因之間的距離相關）培育轉(zhuǎn)基因細胞和生物重組的類型：同源重組 位點特異性重組 轉(zhuǎn)座重組 1.同源重組 發(fā)生在近乎相同的序列之間（如在減數(shù)分裂），只依賴序列的同源性2.位點特異性重組發(fā)

17、生在具有一定相似性的序列之間，涉及特異性位點3.轉(zhuǎn)座重組DNA元件從一個位點轉(zhuǎn)移到另一個位點，通常沒有序列的特異性同源重組：它發(fā)生在含有同源序列的兩個DNA分子之間，即在兩個DNA分子的同源序列之間直接進行交換。進行交換的同源序列可能是完全相同的，也可能是近乎相同的。細菌的接合、轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)化和真核細胞的同源染色體之間的交換等都屬于同源重組。同源重組機制-Holliday模型 過程：（1）兩個同源的DNA相互靠近（2）兩個DNA分子在相同的位置被一種特異性的內(nèi)切酶切開 （3）被切開的鏈交換和連接形，中間物稱為Holliday中間物或Holliday連接.Holliday模型的特點：兩個DNA分子上

18、各有1條鏈在對應的位置發(fā)生兩次斷裂，有分支遷移。如果第二次斷裂點和第一次斷裂點在同一條鏈，則結果為非重組型DNA，如果第二次斷裂點是在另外一條鏈上，則結果為重組型DNA。參與重組的主要蛋白RecA參與大腸桿菌所有的同源重組途徑，有單體和多聚體兩種形式。RecA的主要功能包括兩個完全不同的活性：（1）促進2個DNA分子之間鏈的交換；（2）促進LexA 阻遏蛋白的自我水解（DNA修復）原理： RecA初級位點與單鏈DNA結合，* RecA的次級位點與1個雙鏈DNA分子結合，* RecA催化鏈交換。RecA蛋白促進2個雙鏈DNA分子鏈之間的交換同時滿足三個條件 ：（1） 兩個DNA分子中的一個必須含

19、有單鏈區(qū)域，以便于RecA能夠結合（2） 兩個DNA分子必須含有不低于50bp的同源序列（3） 同源序列內(nèi)必須含有一個自由的末端，以啟動鏈的交換RecA蛋白參與同源重組的具體步驟：（1） 聯(lián)會前階段 RecA通過它的第一個DNA結合位點與單鏈DNA結合，包被DNA，形成蛋白質(zhì)-DNA絲狀復合物（2） 聯(lián)會階段 RecA通過它的第二個DNA結合位點與一個雙鏈DNA分子結合，形成3鏈DNA中間體，隨后單鏈DNA侵入雙鏈DNA，尋找同源序列。（3） 鏈交換階段 由被RecA包被的單鏈DNA從53方向取代雙鏈DNA分子中的同源老鏈，形成異源雙鏈，并發(fā)生分叉遷移。大腸桿菌幾種重要的同源重組途徑：1） R

20、ecBCD途徑 這是大腸桿菌最主要的重組途徑。除了RecBCD以外，還需要RecA、SSB、RuvA、RuvB、RuvC、DNA聚合酶I、DNA 連接酶和DNA旋轉(zhuǎn)酶。此外，還需要chi序列。RecBCD蛋白由RecB、RecC和RecD三個亞基組成。 具有5種酶的活性外切核酸酶V、解鏈酶、核酸內(nèi)切酶、ATP酶和單鏈DNA外切酶。RecBCD蛋白的作用模型RecBCD與雙鏈DNA分子自由末端結合，依靠ATP的水解為動力，延雙鏈移動，解開雙鏈，但它在上面一條鏈比在下面一條鏈移動的速度要快，于是一個單鏈的環(huán)形成了，這種環(huán)隨著它沿DNA雙鏈的移動而增大，先是依靠它的3外切酶活性降解上面的一條鏈。一旦

21、遇到序列，3外切酶活性減弱，而5外切酶活性被激活，于是下面一條的單鏈部分被迅速降解水解，留下上面一條鏈的單鏈部分。產(chǎn)生的單鏈DNA，為RecA作用的底物，由此啟動了鏈的交換和重組反應。RecBCD結合在雙鏈斷裂，RecBCD解鏈并作為外切酶降解DNA，RecBCD停留在chi處，內(nèi)切酶切開單鏈RecD在chi順序解離RecBC繼續(xù)作為解鏈酶 （2）RecF途徑 這主要是質(zhì)粒之間進行重組的途徑，需要的蛋白質(zhì)有RecA、RecJ、RecN、RecO、RecQ和Ruv等。（3）RecE途徑位點特異性重組是指在DNA特定位點上發(fā)生的重組，它需要專門的蛋白質(zhì)識別發(fā)生重組的特異性位點并催化重組反應。位點特

22、異性重組也發(fā)生鏈交換、形成Holliday結構、進行分叉遷移和Holliday結構解離。位點特異性重組可以發(fā)生在2個DNA分子之間（發(fā)生整合），也可以在1個DNA分子之內(nèi)（發(fā)生缺失或倒位）。位點特異性重組的功能包括：（1）調(diào)節(jié)噬菌體的整合；（2）調(diào)節(jié)基因表達；（3）調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育期間程序性的DNA重排。轉(zhuǎn)座重組：DNA上的核苷酸序列從一個位置轉(zhuǎn)位或跳躍到另外一個位置的現(xiàn)象。發(fā)生轉(zhuǎn)位或跳躍的核苷酸序列被稱為轉(zhuǎn)座子或可移位的遺傳元件。（與同源重組和位點特異性重組不同的是，轉(zhuǎn)座子的靶點與轉(zhuǎn)座子并不存在序列的同源性。接受轉(zhuǎn)座子的靶位點可能是隨機的，也可能具有一定的傾向性，這與轉(zhuǎn)座子本身的性質(zhì)有關。）原核

23、生物的轉(zhuǎn)座子的類型及特點：插入序列（IS）；復雜型轉(zhuǎn)座子；復合型轉(zhuǎn)座子（TnA家族）；Mu噬菌體插入序列（IS）能夠從DNA的一個位點插入到另一個位點，導致靶位點基因以及和靶位點基因在同一個操縱子內(nèi)，但位于靶位點基因下游的基因表達受阻稱為極性效應。極性效應：上游基因的敲除或插入導致其下游基因表達受阻的現(xiàn)象。IS：1）較小，長度一般在700bp -1800 bp之間；（2）絕大多數(shù)兩端含有10bp-40bp長的反向重復序列；（3）通常內(nèi)部只有一個基因，編碼的蛋白質(zhì)是專門催化轉(zhuǎn)位反應的轉(zhuǎn)座酶（tnpA），沒有任何抗生素或其它毒性抗性基因；（4）通過“剪切”和“粘貼”的方式進行轉(zhuǎn)座，轉(zhuǎn)座結束后可導致

24、插入點序列重復。（5）有少數(shù)IS，沒有明顯的反向重復序列，它們是通過復制（滾環(huán)復制）與粘貼的方式進行轉(zhuǎn)座的。 復雜型轉(zhuǎn)座子：（1）長度較長；（2）兩側(cè)含有較長的反向重復序列；（3）內(nèi)部含有一個或幾個結構基因。常見的結構基因有：轉(zhuǎn)座酶基因tnpA，解離酶基因tnpR和抗生素抗性基因。（4）轉(zhuǎn)座完成以后可導致約5 bp長的靶位點序列加倍，從而在轉(zhuǎn)座子兩側(cè)產(chǎn)生直接重復序列。復合型轉(zhuǎn)座子：2個IS（同向或反向均可）插入到功能基因（抗生素或其它毒性抗性基因）兩端，形成復合型轉(zhuǎn)座因子。每個IS（作為第一類轉(zhuǎn)座子）可以獨立轉(zhuǎn)位，也可以與插入的功能基因作為整體一起轉(zhuǎn)位。Mu噬菌體：兩側(cè)無反向重復序列，基因組有

25、20多個基因，但只有A基因（編碼轉(zhuǎn)座酶）和B基因（與復制和轉(zhuǎn)座有關）與轉(zhuǎn)座有關聯(lián)。在轉(zhuǎn)座的過程中，可引起靶位點序列重復。在溶源狀態(tài)下，它能在宿主DNA的不同位置間隨機轉(zhuǎn)移。由于Mu轉(zhuǎn)移的靶位點不固定，很容易造成宿主細胞的各種突變，其名稱與它的誘變子角色有關。 轉(zhuǎn)座機制類型 (1) 復制型轉(zhuǎn)座(2) 非復制型轉(zhuǎn)座(3) 保守轉(zhuǎn)座真核生物轉(zhuǎn)座子的類型及特點真核生物的轉(zhuǎn)座子類型：Ac-Ds系統(tǒng)，果蠅的P元件，“水手”元件，MITE；酵母的Ty元件，果蠅的copia元件，LINE和SINE等轉(zhuǎn)座的分子機制：簡單轉(zhuǎn)座、復制型轉(zhuǎn)座真核生物轉(zhuǎn)座的分子機制：簡單轉(zhuǎn)座（“剪切”和“粘貼”機制 ），復制型轉(zhuǎn)座（“

26、復制”和“粘貼”機制）第七章 DNA轉(zhuǎn)錄-RNA生物合成模板鏈（無意義鏈，Watson鏈）可作為模板轉(zhuǎn)錄為RNA的那條鏈，該鏈與轉(zhuǎn)錄的RNA堿基互補。另一條鏈稱為該基因的編碼鏈（有意義鏈，Crick鏈）。原核生物RNA聚合酶的結構與功能所有的三類RNA由同一種RNA聚合酶催化大腸桿菌的RNA聚合酶大小為465 kD，含有2 , 1, 1, 1, 1亞基。 全酶2 核心酶： 2 全酶由核心酶和因子組裝而成。抑制劑：利福霉素和利鏈霉素因子具有兩個功能：(1) 降低酶對非特異性DNA序列的親和性。(2) 大大提高酶對啟動子序列的親和性。(70正常生長(主要的),32熱休克(應急條件下),60N饑餓(

27、應急條件下)全酶的結構與功能:結合DNA ，結合NTPsb和 一起構成活性中心，a聚合酶的組裝，轉(zhuǎn)錄的起始，與調(diào)節(jié)蛋白的相互作用，轉(zhuǎn)錄的起始和延伸，它們也能結合 DNA. r識別啟動子序列。真核細胞的細胞核具有三種RNA聚合酶:RNA聚合酶I(A)：細胞核內(nèi)的rRNA（5S rRNA除外）RNA聚合酶II(B) mRNA snRNARNA聚合酶III(C)小分子RNA（tRNA和5SrRNA）除此以外，線粒體和葉綠體也含有RNA聚合酶。-鵝膏蕈堿是真核生物RNApol抑制劑 。RNA pol詳細的三維結構：鉗、翼、舵、拉鏈、次級通道、離開通道（p163）啟動子是位于結構基因5'端上游的

28、DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確的結合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。 啟動子包括兩段一致序列： “-35 區(qū)” 、“-10 區(qū)增強元件：在某些轉(zhuǎn)錄活性超強的rRNA基因的上游40和60之間的區(qū)域，富含AT的序列，可將轉(zhuǎn)錄活性提高30倍。轉(zhuǎn)錄的起始：RNA聚合酶與啟動子相互作用并形成活性轉(zhuǎn)錄起始復合物的過程，整個反應可分為以下幾步：RNA聚合酶與dsDNA非特異性結合；RNA 聚合酶全酶與啟動子形成封閉復合物；封閉復合物異構化，轉(zhuǎn)變成開放復合物；第一個磷酸二酯鍵形成 ；啟動子清空 細菌基因轉(zhuǎn)錄起始過程中開放復合物的形成 見右圖轉(zhuǎn)錄的延伸當RNApol合成了大約十聚核苷酸的時候延伸開

29、始，這時轉(zhuǎn)錄物的長度足以讓RNA取代因子，失去因子的核心酶通過松散的“滑動鉗”構象握住DNA，以更快的速度沿著模板鏈向前推進。轉(zhuǎn)錄泡則隨著核心酶的移動而移動，其大小維持在17 bp左右。轉(zhuǎn)錄泡的維持不僅需要聚合酶在轉(zhuǎn)錄泡前面解鏈以使新的模板鏈序列得以暴露，而且還要允許轉(zhuǎn)錄泡后面的DNA重新形成雙鏈。解鏈形成的超螺旋可被結合在轉(zhuǎn)錄泡前面的拓撲異構酶解除。由于轉(zhuǎn)錄的方向始終是從53，新參入的核苷酸總是被添加在RNA鏈的3-OH端。每參入一個新的核苷酸，RNA-DNA雜交雙鏈必須發(fā)生旋轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)錄的終止兩種機制：依賴于因子的終止；不需要因子，但需要RNA轉(zhuǎn)錄物3-端一段被稱為終止子的序列。不需要因子的轉(zhuǎn)

30、錄終止：RNA聚合酶到達終止子的時候暫停，發(fā)夾結構形成，發(fā)夾結構破壞了RNA聚合酶和它的RNA產(chǎn)物之間的作用，富含U-的序列很容易與模板鏈解離，轉(zhuǎn)錄復合物解體，轉(zhuǎn)錄終止.依賴于因子的終止：轉(zhuǎn)錄復合體通過因子輔助，特異性識別自身合成RNA的富含胞苷和少含鳥苷的區(qū)域與莖-環(huán)區(qū)相連結構為轉(zhuǎn)錄終止信號，并從模板DNA解離釋放的過程。 真核生物DNA轉(zhuǎn)錄啟動子包括核心啟動子和上游控制元件（UCE）轉(zhuǎn)錄終止需要一種特異性的DNA結合終止因子 mRNA的基因轉(zhuǎn)錄受到多種順式作用元件的控制，包括核心啟動子、調(diào)控元件、增強子和沉默子。核心啟動子包括：TATA盒、起始子（Inr）、TFIIB識別元件（BRE）、下

31、游啟動子元件（DPE）和GC盒。上游控制元件：在啟動子上游存在的TATA框,CAAT框和多個GC框,它們均對啟動子的啟動過程起調(diào)控作用。順式作用元件：在同一條核苷酸鏈上起調(diào)控基因作用的核酸序列弱化子：RNA合成終止時，起終止轉(zhuǎn)錄信號作用的那段DNA序列。沉默子：是一種抑制基因表達的順式作用元件第八章 轉(zhuǎn)錄后加工基因轉(zhuǎn)錄的直接產(chǎn)物被稱為初級轉(zhuǎn)錄物。初級轉(zhuǎn)錄物一般是無功能的，它們在細胞內(nèi)必須經(jīng)歷一些結構和化學的變化即所謂的轉(zhuǎn)錄后加工以后才會有功能。RNA后加工主要有：增減某些氨基酸、修飾某些氨基酸真核細胞mRNA前體的后加工加工形式 1) 5-端 = 加帽2) 3-端 = 加尾3) 內(nèi)部 = 剪接

32、4) 內(nèi)部=甲基化 5) 編碼區(qū)=編輯加帽和甲基化:帽子結構和類型 0、I和 II型,加帽反應：共轉(zhuǎn)錄1) 酶,磷酸水解酶；mRNA鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶；鳥嘌呤-7-甲基轉(zhuǎn)移酶 2) 步驟開始于mRNA 5-三磷酸的 磷酸根水解,留下的5-二磷酸進攻GTP，與GMP形成共價交聯(lián)，同時釋放出PPi.鳥嘌呤隨后在N7位置被甲基化，甲基供體為S-腺苷甲硫氨酸為什么要有帽子？提高mRNA的穩(wěn)定性參與識別起始密碼子的過程，提高mRNA的可翻譯性有助于mRNA通過核孔從細胞核運輸?shù)郊毎|(zhì)提高剪接反應的效率。帽子結構的功能:(1)有助于mRNA越過核膜，進入胞質(zhì)； (2)保護5不被酶降解； (3)翻譯時供IF（起始

33、因子）和核糖體識別。為什么只有mRNA加帽?之所以只有mRNA和某些snRNA才有帽子結構，是因為它們都由聚合酶II催化，當TFIIH磷酸化CTD重復序列后，它即可以將轉(zhuǎn)錄因子DSIF 招募到轉(zhuǎn)錄復合物，而新加入到復合物之中，DSIF隨后將另外一種轉(zhuǎn)錄因子NELF招募進來，以阻滯轉(zhuǎn)錄。上述暫停允許加帽酶進入，來修飾轉(zhuǎn)錄物的5-端。第三種轉(zhuǎn)錄因子P-TEFb是一種激酶，在帽子結構形成不久也被招募到復合物，然后磷酸化CTD的Ser2和NELF，NELF隨之失活，聚合酶II繼續(xù)延伸。為什么必須有尾巴？保護mRNA免受3-外切核酸酶的消化，提高mRNA的穩(wěn)定性。PABP能夠與帽子相互作用增強mRNA的

34、可翻譯性，提高其翻譯的效率；影響最后一個內(nèi)含子的剪接；某些本來缺乏終止密碼子的mRNA通過加尾反應創(chuàng)造終止密碼子。在UG后加尾可產(chǎn)生UGA，在UA后加尾產(chǎn)生UAA；通過選擇性加尾調(diào)節(jié)基因的表達。核酶：是指本質(zhì)為RNA或以RNA為主含有蛋白質(zhì)輔基的一類具有催化功能的物質(zhì)。GU-AG規(guī)則RNA內(nèi)含子序列 5' 端 的起始兩個核苷酸總是 5'-GU-3' ，并且其 3' 端 的最后兩個核苷酸總是 5'-AG-3' 。左邊的剪接位點稱供體（donor）位點，右邊的剪接位點稱受體（acceptor）位點。mRNA前體的剪接機制 ：mRNA前體的剪接是高度精

35、確的。其精確性一方面取決于位于外顯子和內(nèi)含子交界處的剪接信號（可以將其視為內(nèi)因），另外一方面取決于5種被稱為snRNP（核內(nèi)小核糖核蛋白）的核糖核酸蛋白質(zhì)復合物（可以將其視為外因）。剪接反應的“內(nèi)因”剪接信號剪接反應的“外因”snRNP和剪接因子剪接反應兩次轉(zhuǎn)酯反應剪接體的組裝snRNP:核內(nèi)小核糖核蛋白拼接體：主要由mRNA前體、mRNA前體結合蛋白和5種snRNP在細胞內(nèi)，安裝一定的次序組裝成的超分子復合物BBP:分支點結合蛋白順式作用元件：指同一DNA分子中具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的特異DNA序列。包括啟動子、增強子等。反式作用因子：指能直接或間接地識別或結合在各類順式作用元件核心序列上參與調(diào)控

36、靶基因轉(zhuǎn)錄效率的蛋白質(zhì)。多為轉(zhuǎn)錄因子。內(nèi)含子的歸巢：Intron（基因內(nèi)區(qū)）中有ORF，可編碼內(nèi)切酶，使intron 以原來的DNA形式或作為RNA的DNA 拷貝插入一條新的靶位點。gRNA：指導RNA前體的后加工核糖核酸酶P：原核生物中，切除轉(zhuǎn)移核糖核酸(tRNA)前體的5端序列產(chǎn)生成熟tRNA 5端的核糖核酸內(nèi)切酶。該酶含有蛋白質(zhì)和RNA兩組分，其蛋白質(zhì)組分沒有催化活性，而RNA組分具有全酶的催化活性，是一種核酶。第九章 蛋白質(zhì)的生物合成擺動規(guī)則：密碼子在與反密碼子之間進行堿基配對的時候，前兩個堿基嚴格遵守標準的堿基配對規(guī)則，第三個堿基則具有一定的自由度。擺動規(guī)則的意義在于使得在翻譯的過程

37、中，tRNA和mRNA有一對堿基不是嚴格配對，氫鍵較弱更容易分離，從而加快翻譯的速度。損傷mRNA的搶救合成：無終子密碼子的缺陷的mRNA結合的核糖體當翻譯到斷裂的末端，將裹足不前，難以解離。E. coli和其它細菌已發(fā)展了一套專門的機制處理這些無終止密碼子的有缺陷的mRNA，這種機制為反式翻譯。反式翻譯不同于一般的順式翻譯，它將兩個mRNA翻譯成一條融合的肽鏈，其中有一個mRNA分子無終止密碼子，另一個mRNA分子是tmRNA翻譯的抑制劑林可霉素、氯霉素、紅霉素、鏈霉素和四環(huán)素林可霉素：抑制原核生物的轉(zhuǎn)肽活性氯霉素：抑制原核生物的轉(zhuǎn)肽活性，結合在L16附近，似乎阻止氨酰-tRNA的酰胺基端與

38、A部位的正確結合。紅霉素：阻止多肽鏈離開通道的入口。鏈霉素：干擾密碼子與反密碼子的配對，導致mRNA的誤讀，也能抑制起始反應。四環(huán)素：抑制酰胺-tRNA與A部的結合。第十章 多肽鏈折疊與翻譯后加工蛋白質(zhì)折疊的三條途徑：（）不依賴于分子伴侶的折疊；（）受熱激蛋白幫助的折疊；（）受熱激蛋白和伴侶蛋白復合物幫助的折疊幾種有促進蛋白折疊功能的大分子:1. 分子伴侶2. 蛋白二硫鍵異構酶 3. 肽-脯氨酰順反異構酶 分子伴侶：細胞中一類保守蛋白質(zhì)，可識別肽鏈的非天然構象，促進各功能域和整體蛋白質(zhì)的正確折疊。 （1）熱休克蛋白(heat shock protein, HSP) HSP70、HSP40和Gr

39、eE族 （2）伴侶素(chaperonins) GroEL和GroES家族熱休克蛋白促進蛋白質(zhì)折疊的基本作用：結合保護待折疊多肽片段，再釋放該片段進行折疊。形成HSP70和多肽片段依次結合、解離的循環(huán)。 伴侶素的主要作用:為非自發(fā)性折疊蛋白質(zhì)提供能折疊形成天然空間構象的微環(huán)境。10.2 蛋白質(zhì)翻譯后的定向與分揀 定向與分揀：蛋白質(zhì)合成后所經(jīng)歷的轉(zhuǎn)移和定位的過程稱為蛋白質(zhì)的定向與分揀。細胞內(nèi)蛋白質(zhì)定向、分揀的途徑分為：共翻譯途徑在翻譯延伸還沒有結束的時候就被啟動；翻譯后途徑需要在翻譯結束以后才被啟動。10.2.1 共翻譯途經(jīng)信號肽：是一段在一級結構上連的續(xù)氨基酸序列，是蛋白質(zhì)分揀信號。能夠引導蛋

40、白質(zhì)從細胞液進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、胞外、細胞核、線粒體葉綠體和過氧化物酶體。信號斑：是存在于已折疊的蛋白質(zhì)表面的三維分揀信號。信號識別顆粒：Signal Recognition Particle（）第11章 原核生物基因表達調(diào)控基因表達調(diào)控水平：水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后加工水平、翻譯水平、翻譯后加工水平基因表達的調(diào)控方式：負調(diào)控:調(diào)控蛋白（阻遏蛋白）+DNA序列阻遏基因的表達(相應蛋白質(zhì)降低) 正調(diào)控:調(diào)控蛋白（激活蛋白）+DNA序列促進基因的表達(相應蛋白質(zhì)增加)相關效應物：誘導物或輔阻遏物負調(diào)控：無調(diào)節(jié)蛋白存在時 操縱子中的結構基因是表達的；加入調(diào)節(jié)蛋白與DNA序列相互作用之后，基因的表達就

41、被關閉了，這樣的調(diào)控就叫做負調(diào)控。負調(diào)控系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)蛋白叫做阻遏蛋白。在負調(diào)控中，反式作用的阻遏物與順式作用的操縱子區(qū)域結合，關閉操縱子，終止基因的轉(zhuǎn)錄。許多阻遏物都能以活性和無活性的狀態(tài)存在。 誘導物的結合能使阻遏物失活，輔阻遏物的結合則能激活無活性的阻遏物，使之變?yōu)榛钚誀顟B(tài)。正調(diào)控：無調(diào)節(jié)蛋白存在時基因是關閉的，加入調(diào)節(jié)蛋白后調(diào)節(jié)蛋白與DNA的結合能促進結構基因的表達，這樣的調(diào)節(jié)方式叫做正調(diào)控。正調(diào)節(jié)中的調(diào)節(jié)蛋白叫做激活蛋白或正調(diào)節(jié)蛋白。操縱子處于關閉狀態(tài)是指它的表達水平很低，但總還是存在本底水平的基因表達。在正調(diào)控中，反式作用因子須與順式作用位點結合以利于基因的轉(zhuǎn)錄。在正調(diào)控中，反式作用

42、因子須與順式作用位點結合以利于基因的轉(zhuǎn)錄。順式作用元件：是指對基因表達有調(diào)節(jié)活性的DNA序列，其活性只影響與其自身同處在一個DNA分子上的基因；同時，DNA序列通常不編碼蛋白質(zhì)，多位于基因旁側(cè)或內(nèi)含子中，如啟動子、操縱子、終止子。順式作用元件的作用屬于順式作用。反式作用因子是能調(diào)節(jié)與它們接觸的基因的表達的各種擴散分子（RNA或蛋白質(zhì)），如轉(zhuǎn)錄因子；其編碼基因與其識別或結合的靶核苷酸序列不在同一個DNA分子上?；虻漠a(chǎn)物（RNA或蛋白質(zhì)）的作用屬反式作用?；虻漠a(chǎn)物（RNA或蛋白質(zhì)）的作用屬反式作用調(diào)控基因則屬于反式作用元件其編碼產(chǎn)生的調(diào)控蛋白為反式作用因子。操縱子：是原核生物基因表達和調(diào)控的基

43、本單位，包括結構基因和調(diào)控元件（調(diào)節(jié)基因、操作子（操縱基因，operator）和啟動子、終止子）兩部分。結構基因：操縱子中被調(diào)控的編碼蛋白質(zhì)的基因。調(diào)節(jié)基因：編碼與操縱子結合的調(diào)控蛋白的基因。操作子(操縱基因)：凡能與調(diào)控蛋白特異性結合、從而影響基因轉(zhuǎn)錄強弱的序列，不論其對基因轉(zhuǎn)錄的作用是減弱、阻止或增強、開放，都可稱為操作子。效應物：某些特定的物質(zhì)能與調(diào)控蛋白結合，使調(diào)控蛋白的空間構像發(fā)生變化，從而改變其對基因轉(zhuǎn)錄的影響，這些特定物質(zhì)可稱為效應物。誘導物：其中凡能引起誘導發(fā)生的分子稱為誘導物（inducer），它與調(diào)控蛋白的結合能促進基因的表達。誘導物能與處于活性狀態(tài)的阻遏蛋白結合，使之失活

44、而不能與操作子結合，于是RNA聚合酶就能起始轉(zhuǎn)錄。輔阻遏物：能導致阻遏發(fā)生的分子稱為輔阻遏物（corepressor），它與調(diào)控蛋白的結合能阻遏基因的表達式。輔阻遏物與阻遏物結合,使之變?yōu)榛钚孕问?激活)后與操作子結合,抑制操縱子.操縱子類型：誘導性操縱子（如乳糖操縱子）、阻遏型操縱子（如色氨酸操縱子）別乳糖：乳糖的一種代謝產(chǎn)物。一種乳糖異構體，為乳糖操縱子的天然誘導物。操作子：凡能與調(diào)控蛋白特異性結合、從而影響基因轉(zhuǎn)錄強弱的序列，不論其對基因轉(zhuǎn)錄的作用是減弱、阻止或增強、開放，都可稱為操作子。葡萄糖效應:指當葡萄糖和其它糖類一起作為細菌的碳源時葡萄糖總是優(yōu)先被利用，葡萄糖的存在阻止了其它糖類

45、的利用的現(xiàn)象。乳糖操縱子的結構由阻遏蛋白基因（I）、啟動子（P）、操縱基因（O）和編碼與乳糖利用密切相關的三個酶的結構基因：Z（半乳糖苷酶）、Y （乳糖透過酶）、A （轉(zhuǎn)乙酰酶）區(qū)段組成。阻遏蛋白基因（I）屬于組成型的調(diào)控，是經(jīng)常表達的，因此，lac操縱子通常是處于關閉狀態(tài)的。lac操縱子的調(diào)控1、由調(diào)節(jié)基因表達的乳糖阻遏蛋白的可誘導的負調(diào)控2、由CAP-cAMP引起的正調(diào)控lac基因可誘導的負調(diào)控：1，lac阻遏蛋白與操作子結合，在沒有乳糖存在時，lac操縱子處于阻遏狀態(tài)。I基因在其自身的啟動子Pi控制下，低水平、組成型表達產(chǎn)生阻遏蛋白R，每個細胞中僅維持約10個分子的阻遏蛋白。R以四聚體形

46、式與操縱子結合，阻礙了RNA聚合酶與啟動子Plac的結合，阻止了基因的轉(zhuǎn)錄起動。2 阻遏蛋白與操作子的解離，當有乳糖存在時，細胞中很低水平的乳糖透過酶能使乳糖透過細胞膜被細胞攝取。乳糖受半乳糖苷酶的催化轉(zhuǎn)變?yōu)閯e乳糖，別乳糖是天然的誘導物，與阻遏蛋白結合使之變構，由四聚體解聚成單體，導致其與操作子的親和力下降1000倍，結構基因開放，RNA聚合酶結合，轉(zhuǎn)錄開始。乳糖對lac操縱子的誘導作用：一些化學合成的乳糖類似物，不受半乳糖苷酶的催化分解，卻也能與R特異性結合使R構象變化，誘導lac操縱子的開放。異丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiog- alactoside，IPTG)：誘導劑，不被

47、細菌代謝而十分穩(wěn)定，與阻遏蛋白特異性結合，并誘導阻遏蛋白構象發(fā)生改變，導致lac操縱子的開放。X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷）：人工合成的半乳糖苷，可被半乳糖苷酶水解產(chǎn)生藍色化合物沉淀，因此可以用作半乳糖苷酶活性的指示劑。IPTG作為誘導物與LacI的基因產(chǎn)物阻遏蛋白結合，使之轉(zhuǎn)變?yōu)闊o活性形式而不能與操作子結合，于是RNA聚合酶就能起始基因的轉(zhuǎn)錄（LacZ基因），表達。LacZ基因表達產(chǎn)物半乳糖苷酶則將底物X-gal水解，產(chǎn)生藍色化合物。假如多克隆位點中插入了外源基因，則LacZ不能表達，于是X-gal也不被水解，底物就仍為白色。重組菌落就是白色，非重組菌就是藍色。所謂藍白斑篩選。色氨酸操縱子的結構：啟動子（trpP）、一個操