實用pcr流程表

1、臨床PCR僉驗流程記錄表檢驗日期： 檢驗項目： HBV-DNA 擴增儀中保存文件名 使用說明：嚴格按單一流向進行實驗，即試劑準備區(qū)-標本制備區(qū)-擴增區(qū) ，嚴禁逆向移動。本記錄表的流向亦遵循此流程；各項工作 執(zhí)行后在相應項目前的方框內打；本記錄表最后歸檔保存在 PCR實驗室擴增區(qū)的專用文件夾中，以備查找。實驗前準備口試劑在有效期內口擴增儀、加樣器、金屬浴、溫濕度計等儀器在校準有效期內（校準之日起1年）口生物安全柜的濾膜在使用有效期內口離心管、帶濾芯吸頭已經過質檢合格口各區(qū)按消毒液配制 SOP配制500mg/L含氯消毒液、2000mg/L含氯消毒液與70%酉精，即用即配。口打開通風設備操作者試劑準

2、備區(qū)實驗前：口更換專用工作服、戴口罩、帽子、鞋套口實驗臺面清潔（500mg/L含氯消毒液、70%酉精或水擦拭）冰箱溫度：冷藏室（28C）C; 冷凍室（-20 ±2C）C實驗室溫度 C （允許范圍：1530C）;相對濕度：（允許范圍：30%70%）PCR式劑來源：試劑廠家：口深圳匹基生物工程有限公司批號：檢驗項目：HBV-DNA 本次實驗用量： 人份；剩余量： 人份其她有關試劑配制：儀器設備使用：離心機：口正常 口不正常； 振蕩器：口正常 口不正常；生物安全柜：口正常 口 不正常實驗后：口按實驗室清潔消毒 SOP青潔實驗室臺面、地面、加樣器與離心機，并進行紫外線照射 30分鐘以上?？诎?/p>

3、實驗室廢棄物處理 SOP處理實驗廢棄物。操作者檢驗日期：檢驗項目： HBV-DNA樣本處理區(qū)實驗前：口更換專用工作服、戴口罩、帽子、鞋套口實驗臺面清潔（500mg/L含氯消毒液、70%酉精或水擦拭）冰箱溫度：冷藏室（28C）C; 冷凍室（-20 ±2C）C實驗室溫度 C（允許范圍：1530C）;相對濕度：（允許范圍：30%70%）HBV-DN屆性室內質控物來源：濃度及批號：擴增位置：HBV-DN屈性室內質控物來源：批號:擴增位置：所處理的HBV-DN“本（對應標本接收的唯一編號）及擬擴增位置19172533414957657381892101826344250586674829031

4、1192735435159677583914122028364452606876849251321293745536169778593614223038465462707886947152331394755637179879581624324048566472808896核酸提取及加樣過程：口按乙型肝炎病毒 DNA熒光定量PCR操作程序SOP進行。儀器設備使用：生物安全柜：口正常 口不正常； 恒溫金屬?。篊;離心機：口正常 口不正常； 振蕩器： 口正?？诓徽＃坏蜏仉x心機：制冷：口正常 口不正常；離心：口正常口不正常實驗后：口按實驗室清潔消毒 SOP青潔實驗室臺面、地面、加樣器與離心機，并進行

5、紫外線照射 30分鐘以上?？诎磳嶒炇覐U棄物處理 SOP處理實驗廢棄物?？谑褂煤髽吮纠鋬霰４?3個月，以備復查。操作者擴增及產物分析區(qū)實驗前：口更換專用工作服、戴口罩、帽子、鞋套口實驗臺面清潔（500mg/L含氯消毒液、70%酉精或水擦拭）實驗室溫度 C （允許范圍：1530C）;相對濕度：（允許范圍：30%70%）LightCycler擴增儀操作：口開機自檢及運行正常；口按LightCycler操作使用SOP進行編程、參數設定HBV-DNA準曲線計算值 ：Slope 值: Intercept 值: r2 值:室內質控結果：陰性質控物結果：;陽性質控物結果：口填寫室內質控記錄、質控圖；就是否失控

6、：口否口就是室內質控結果：陰性質控物結果：;陽性質控物結果：口填寫室內質控記錄、質控圖；就是否失控：口否口就是失控原因及分析：（失控判斷標準及原因分析按室內質控SOP進行）實驗結果：見所附擴增儀打印結果實驗結果有效性判斷：有效口無效（依據實驗結果有效性判斷 SOP進行）實驗后：口按實驗室清潔消毒 SOP青潔實驗室臺面、地面、加樣器與離心機，并進行紫外線照射 30分鐘以上?？诎磳嶒炇覐U棄物處理 SOP處理實驗廢棄物。操作者1、 操作步驟 :1.1.1 取n個1、5ml的滅菌離心管，作好標記。（n=樣本數+1管HCV陰性對照+1管HCV強陽性對照 +1 管 HCV 臨界陽性對照 ）1.1.2 向上

7、述離心管中分別加入 25ul 蛋白酶溶液。1.1.3 分別加入待測樣本、 HCV 陰性對照、 HCV 臨界陽性對照與HCV 強陽性對照各200ul、1.1.4 加入 200ul 新鮮配制的裂解液工作液,蓋上蓋子 ,振蕩 15秒,充分混勻。 （注意 :不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中）。1.1.5 56攝氏度溫浴15分鐘。瞬時離心,以去除管蓋上的滴液。1.1.6 加入 250ul 無水乙醇,蓋上蓋子,徹底混勻（振蕩15秒）。在室溫下靜置5 分鐘 （15-25攝氏度 ）。 注意 :如果環(huán)境溫度超過25攝氏度 ,無水乙醇需預冷。 瞬時離心,以去除管蓋上的滴液。1.1.7 將 n 個核酸提取柱放

8、入收集管中,小心地將步驟1.2.6 中的液體移入核酸提取柱中。蓋上蓋子 ,6000*g 離心 1 分鐘。倒掉收集管中的廢液,將提取柱重新放入收集管中。（如果離心后核酸提取柱中仍有部分液體,以更高的速度再次離心,確保提取柱中無殘余的液體）1.1.8 小心的打開核酸提取柱的蓋子,加入500ul 洗液1,蓋上蓋子,6000*g 離心1 分鐘,倒掉收集管中的廢液,將提取柱重新放入收集管中。1.1.9 小心的打開核酸提取柱的蓋子,加入500ul 洗液2,蓋上蓋子,6000*g 離心1 分鐘,倒掉收集管中的廢液,將提取柱重新放入收集管中。1.1.10 小心的打開核酸提取柱的蓋子,加入500ul 無水乙醇,

9、蓋上蓋子,6000*g 離心 1 分鐘 ,丟棄收集管,將提取柱放入新的收集管中。1.1.11 20000*g 高速離心 3 分鐘 ,徹底去除乙醇。1.1.12 丟棄收集管，將核酸提取柱放入干凈的1、5ml離心管中，打開提取柱的蓋子，56攝氏度溫浴3分鐘，以徹底去除殘余的液體。1、213將核酸提取柱放入另一干凈的1、5ml離心管中，小心打開提取柱的蓋子，加入60ul 洗脫液（請將洗脫液加到膜的中央），蓋上蓋子，室溫靜置5分鐘。20000*g高速離心1 分鐘收集濾出液，做好標記，4攝氏度保存?zhèn)溆?。提取的病毒核酸應?小時內用于PCR擴增，或在-70攝氏度下可以保存一個月。2、擴增試劑準備（PCR前

10、準備區(qū)）從試劑盒中取出HCV RT-PCR反應液、Enzyme Mix ,在室溫下融化后,2000*g離心5 秒。設所需要的PCR反應管數（玻璃毛細管）為n（n=樣本數+1管空白對照+1管HCV 陰性對照+1管HCV強陽性對照+1管HCV臨界陽性對照+4管HCV定量標準品），每個測試反應體系配制如下表試齊HCV RT-PCR反應液Enzyme Mix用量n*13uln*2ul計算好各試劑的使用量，加入到一適當體積試管中，充分混勻均勻后2000*g離心10秒, 向各玻璃毛細管中分裝15ul,轉移至樣本處理區(qū)。3 .加樣（樣本處理區(qū)）吸取10ul樣本處理步驟1.2.13中收集得到的RNA溶液及HC

11、V定量標準品分別加入到上述反應管中（空白對照直接加入10ul洗脫液），蓋緊反應管管蓋，連同Roche專用金 屬反應管套放在離心機中，于2000*g離心10秒，將毛細管轉移到檢測區(qū)。將毛細管排 放好放入熒光PCR檢測儀內，記錄樣本擺放順序。4 、RT-PCR反應（檢測區(qū)）4、1循環(huán)條件設置ProgramCyclesTemperatureIncubationTemperatureAcquisitioAnal攝氏度Time(min:sec)TransitionRate(攝氏度/sec)nModeysisMod e115030:0020NoneNon e219515:0020NoneNon e3459

12、500:0520NoneQua ntifi catio n5000:3020Single7200:2010None反應體系為25ul、具體設置方法請參照各儀器使用說明書。5 .2儀器檢測通道選擇選擇F1檢測通道：HCV內對照（IC）選擇F2檢測通道。6 .3樣本的設定在擴增開始前條件設定時，將HCV定量標準品設為“ Standard”并輸入試劑盒內給定濃度值,待檢樣本與對照品設定為“ Unknown”。結果分析條件設定1. 對HCV的曲線與HCV內對照（IC）的曲線進行分別分析。2. 分析方式選擇 Fit Points,基線調整選擇 Arithmetic,閾值（threshold）設定原則以閾

13、值 線剛好超過正常HCV陰性對照曲線的最高點，且正常HCV陰性對照病毒滴度為0、 0IU/ml為準。具體設置方法請參照各儀器使用說明書。質控標準1 .將HCV定量標準品1-4的濃度值輸入，儀器將自動以HCV定量標準品的濃度值為橫坐標 ,以其實際測得的外標Ct 值為縱坐標給出標準曲線,標準曲線的擬與度絕對值應大于等于 0、 980,四個 HCV 定量標準品的 Ct 值都應<38、 0,否則視為定量結果無效。2 . HCV 陰性對照、空白對照 HCV RNA 應為 0、 0IU/ml;HCV 強陽性對照 HCV RNA 應 為 5、 0E+05-1、 0E+07IU/m l; HCV 臨界陽

14、性對照應為1、 0E+03-1、 0E+05 IU/ml; 且HCV陰性對照、HCV臨界陽性對照中HCV內對照（IC）的Ct值都應小于等于33,否則 此次實驗視為無效。所有實驗從樣本處理開始重做。結果判斷1. 檢測樣本中 1、 0E+03 IU/ml 小于等于 HCV RNA 小于等于5、 0E+07 IU/ml, 測定結果有效 ,可直接報告相應的濃度值。2. 檢測樣本中 HCV RNA 大于 5、 0E+07 IU/ml, 可按實際測得值報告相應的病毒滴度,亦可將該樣本用正常人血漿按 10 倍梯度稀釋到本試劑盒定量檢測線性范圍內后重新 測定 ,測定結果應以稀釋倍數進行校正。3. 檢測樣本中 0、 0IU/ml 小于 HCV RNA 小于 1、 0E+03 IU/ml, 且 HCV 內對照 （IC） 的 Ct 值都應小于