病毒檢驗技術

1、第十七章病毒檢驗技術 本 章 內 容 第一節(jié) 標本的采集、處理與運送 1第二節(jié) 病毒的分離與鑒定2第三節(jié) 病毒學檢測及診斷3學習目標及重點 學習目標： 掌握病毒標本采集和送檢應遵循的原則；病毒檢驗鑒定常用技術熟悉病毒血清學診斷常用的方法了解病毒感染的實驗室快速診斷學會病毒的培養(yǎng)基本操作本章重點： 病毒標本采集和運送原則。病毒學診斷及鑒定常用方法。病毒培養(yǎng)的基本操作。病毒學檢驗技術是用實驗室檢驗方法對臨床和流行病學現場送檢的標本（如人或宿主的血液、組織、尿、糞便和組織液等）進行病毒學的定性和定量分析，為病毒感染和病毒性疾病的診斷、治療和預防提供科學依據。檢驗程序包括標本的采集、分離培養(yǎng)鑒定、快速

2、診斷。第一節(jié) 標本的采集、處理與運送 一、標本的采集與處理1. 采集時間：發(fā)病早期或急性期盡快采集。很多急性病毒感染，癥狀出現前病毒已經開始釋放，癥狀初期病毒量即迅速達到峰值，之后平緩下降至疾病痊愈，不過也有例外。第一節(jié) 標本的采集、處理與運送 一、標本的采集與處理2.采集部位：取決于臨床癥狀和所懷疑感染的病毒。從病原體入侵部位取材從病原體感染的靶器官取材根據病原體的排泄途徑取材從環(huán)境中采集標本 如：流感病毒感染-鼻咽拭子 乙型腦炎病毒感染-腦脊液 輪狀病毒感染-糞便 乙型肝炎病毒感染-血液第一節(jié) 標本的采集、處理與運送 一、標本的采集與處理3.采集方法與處理 提高病毒的分離率，防止標本污染。

3、采集時無菌操作,可加入抗生素以殺死雜菌二、二、標本的運送與保存 1.1.標本的運送盡快送檢冷凍、冷藏運輸防漏、專人、標記2.2.標本的保存-70可較長時間保存可加入甘油或二甲基亞砜（DMSO）、Hanks液或小牛血清等以防病毒失活第一節(jié) 標本的采集、處理與運送 n 不同的病毒分離時采用不同的分離方法,這主要取決于目的病毒的生物學特性。n 主要有細胞培養(yǎng)法、雞胚培養(yǎng)法、動物接種法等,而對細胞、雞胚不敏感,又沒有合適動物模型的病毒,可采用基因克隆的方法。第二節(jié) 病毒的分離與鑒定一、 病毒的分離培養(yǎng) 2.雞胚培養(yǎng) 第二節(jié) 病毒的分離與鑒定原代細胞培養(yǎng)二倍體細胞培養(yǎng)傳代細胞 羊膜腔接種尿囊腔接種卵黃囊

4、接種絨毛尿囊膜接種組織細胞培養(yǎng) 雞胚培養(yǎng) 動物接種是將離體活組織塊或分散的組織細胞加以培養(yǎng)的技術總稱，為病毒分離鑒定中的最常用的基本方法。（一）組織細胞培養(yǎng) 雞成纖維細胞Hep-2細胞細胞培養(yǎng)瓶Vero細胞第二節(jié) 病毒的分離與鑒定1.原代細胞原代細胞是指從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞。原代細胞的培養(yǎng)是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行培養(yǎng)。因此，較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時的細胞保持原有細胞的基本性質，如果是正常細胞，仍然保留二倍體數。2.二倍體細胞是指原代細胞在體外分裂50代以后仍能保持其二倍染色體數目。二倍體細胞株來源于正常人胎兒組織，主要用于培養(yǎng)病毒制備疫苗等。3.傳代細

5、胞傳代細胞來源于腫瘤細胞或細胞株傳代過程中變異的細胞稱為傳代細胞，它們能在體外無限期地傳代。大多是腫瘤細胞或突變的二倍體細胞。常用的傳代細胞株有Hela細胞（人宮頸癌細胞），Hep-2（人喉上皮癌細胞）、Vero（非洲綠猴腎細胞）等。152.雞胚培養(yǎng)第二節(jié) 病毒的分離與鑒定雞胚培養(yǎng)法是用來培養(yǎng)某些對雞胚敏感的動物病毒的一種培養(yǎng)方法，此方法可用以進行多種病毒的分離、培養(yǎng)，毒力的滴定，中和試驗以及抗原和疫苗的制備等。16一般選用914d的雞胚來源充足、組織分化程度低、本身很少攜帶病毒和細菌、對接種病毒不產生抗體及病毒較易增殖等2.雞胚培養(yǎng)優(yōu)點：第二節(jié) 病毒的分離與鑒定選擇不同的接種部位是病毒分離成

6、功的關鍵常用的主要有： 尿囊腔接種、羊膜腔接種、卵黃囊接種、絨毛尿囊膜接種2.雞胚培養(yǎng)第二節(jié) 病毒的分離與鑒定不同病毒在雞胚的不同部位的生長特性差異很大2.雞胚培養(yǎng)尿囊腔接種羊膜腔接種尿囊腔羊膜腔常用接種途徑： 尿囊腔接種、羊膜腔接種、卵黃囊接種、絨毛尿囊膜接種常用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的適應和傳代培養(yǎng)常用于臨床流感病毒初次分離第二節(jié) 病毒的分離與鑒定卵黃囊接種絨毛尿囊膜接種卵黃囊絨毛尿囊膜人工氣室羊膜腔氣室絨毛尿囊膜尿囊腔 卵白2.2.雞胚培養(yǎng)主要用于蟲媒病毒、衣原體及立克次體的分離和繁殖。常用于牛痘病毒、天花病毒、單純皰疹病毒的分離卵卵黃黃囊囊第二節(jié) 病毒的分離與鑒定3.

7、動物接種常用的實驗動物有小白鼠、乳鼠、豚鼠、家兔、猴和雞等常用的接種途徑包括皮下、皮內、腹腔、靜脈、角膜、鼻腔及腦內接種等方式第二節(jié) 病毒的分離與鑒定二、病毒增殖的觀察（一）病毒在細胞內增殖的鑒定指標 1細胞形態(tài)的改變 2紅細胞吸附 3細胞培養(yǎng)液pH值改變（二）病毒數量及病毒感染性測定 1血凝試驗 2中和試驗 3空斑形成試驗 4半數感染量（ID50）和組織培養(yǎng)半數感染量（TCID50） 第二節(jié) 病毒的分離與鑒定二、病毒增殖的觀察（一）病毒在細胞內增殖的鑒定指標 1細胞形態(tài)的改變 （1） 細胞病變效應（cytophathic effect，CPE）第二節(jié) 病毒的分離與鑒定正常細胞 病變細胞是指某

8、些病毒特別是無包膜的病毒感染組織細胞后，正常生長的梭形細胞變圓、變性、壞死、溶解及從培養(yǎng)瓶壁脫落，細胞堆積形成葡萄狀第二節(jié) 病毒的分離與鑒定（2）多核巨細胞1細胞形態(tài)的改變多見于有包膜的病毒，如呼吸道合胞病毒、麻疹病毒等，由感染細胞融合而成多核巨細胞第二節(jié) 病毒的分離與鑒定（3）包涵體1細胞形態(tài)的改變 某些病毒感染宿主細胞后，細胞內出現一種光學顯微鏡下可見的蛋白質結構，多為圓形、卵圓形或不定形。一般是由完整的病毒顆?；蛏形囱b配的病毒亞基聚集而成，稱為包涵體。第二節(jié) 病毒的分離與鑒定2紅細胞吸附有些病毒感染細胞后,細胞膜上可鑲嵌著病毒基因編碼產生的糖蛋白,其中有些能吸附特定種類的紅細胞,或將細胞

9、培養(yǎng)單層刮下后,經過適當處理,可以凝集特定種類的紅細胞,此類糖蛋白在細胞表面形成刺突,稱為血凝素。3細胞培養(yǎng)液pH值改變二、病毒增殖的觀察病毒感染細胞后，可使細胞的代謝發(fā)生變化，導致培養(yǎng)液pH值改變。第二節(jié) 病毒的分離與鑒定（二）病毒數量及病毒感染性測定二、病毒增殖的觀察1血凝試驗 病毒顆粒紅細胞 某些病毒（如流感病毒）表面的血凝素（HA）能引起人或某些哺乳動物的紅細胞發(fā)生凝集，將這類病毒感染細胞后收集的病毒液作不同稀釋，以發(fā)生血凝反應的病毒液的最高稀釋度作為該病毒的血凝效價（即滴度），可對病毒含量進行半定量測定。血凝現象第二節(jié) 病毒的分離與鑒定能使紅細胞完全凝集的病毒的最高稀釋倍數為該病毒的

10、血凝效價，此效價為1個血凝單位（HAU）第二節(jié) 病毒的分離與鑒定病毒顆粒 紅細胞病毒抗體 血凝抑制試驗 病毒液中若先加入病毒的特異性抗體，抗體與病毒表面的抗原特異性結合，從而抑制病毒與紅細胞的血凝現象，稱為血凝抑制試驗。第二節(jié) 病毒的分離與鑒定2中和試驗（Nt） 在體外孵育病毒與特異性抗體的混合物，使病毒與抗體相互反應，再將混合物接種到敏感的宿主體內，經培養(yǎng)后觀察CPE或紅細胞吸附現象是否消失，即特異性抗體是否中和相應病毒，從而測定殘存的病毒感染力的一種方法3空斑形成試驗第二節(jié) 病毒的分離與鑒定n 是一種檢查和準確測定病毒滴度的方法。n 將稀釋的病毒懸液加入單層細胞培養(yǎng)瓶中。病毒吸附后，再覆蓋

11、一層融化的半固體營養(yǎng)瓊脂，使病毒在單層細胞培養(yǎng)中有限擴散。n 結果是每一個有感染性的病毒在單層細胞中可產生一個局限性的感染灶。用活性染料 (如中性紅) 染色，則活細胞著色，受病毒感染而破壞的細胞不著色，形成肉眼可見的空斑/蝕斑(plaque)。n 每個蝕斑是由一個感染性病毒顆粒形成的，稱作空斑形成單位 (plaque forming unit, PFU)。n 病毒懸液中的感染性病毒量的滴度可用PFUml表示。4半數感染量（ID50）和組織培養(yǎng)半數感染量（TCID50） 測定病毒感染雞胚、動物或細胞后，引起50%死亡或病變的最小量。用來估計病毒感染的強弱程度，但不能準確測定感染性病毒顆粒的多少第

12、二節(jié) 病毒的分離與鑒定 第三節(jié) 病毒學檢測及診斷一、形態(tài)學檢查及診斷 1. 光學顯微鏡檢查： *直接觀察到較大的病毒體（如痘病毒） *包涵體 狂犬病毒感染-嗜酸性包涵體 巨細胞病毒感染-“貓頭鷹眼”狀的嗜酸性包涵體 2. 電子顯微鏡檢查： *透射電子顯微鏡 用于觀察病毒的大小、形態(tài)與結構及細胞內的超微結構等*掃描電子顯微鏡： 用于觀察病毒和細菌表面結構和附屬結構等 一、形態(tài)學檢查及診斷掃描電子顯微鏡 第三節(jié) 病毒學檢測及診斷H1N1流感病毒電子顯微鏡圖片狂犬病病毒電子顯微鏡圖片 第三節(jié) 病毒學檢測及診斷（1）標本制備 超濾法超速離心法接種細胞快速增殖法免疫凝集法（2）常用觀察方法 負染色法 超薄切片法 免疫電鏡法病毒顆粒具有亮度，在周圍較暗的背景上顯示亮點過程與病理切片過程相似免疫組織化學與電鏡技術的結合透射電子顯微鏡 第三節(jié) 病毒學檢測及診斷二、血清學檢測及診斷 原理：用已知的病毒抗原檢測患者血清中的抗體水平或 用已知的病毒抗體直接檢測標本中的病毒抗原1.病毒抗原的檢測：用熒光素、酶或膠體金等標記物標記病毒抗體檢測標本中的相應病毒抗原。如ELISA檢測HBsAg 第三節(jié) 病毒學檢測及診斷2.病毒抗體的檢測：已知病毒抗原多數為通過基因工程技術制備的重組抗原，其次是從患者標本中分