定量PCR基本原理及方法ppt課件

1、定量定量PCR基本原理及方法基本原理及方法基因有限公司基因有限公司 黃妤黃妤熒光定量熒光定量PCR基本原理基本原理熒光定量熒光定量PCR標(biāo)記方法標(biāo)記方法熒光定量熒光定量PCR不同方法學(xué)的應(yīng)用不同方法學(xué)的應(yīng)用內(nèi) 容內(nèi) 容 定量定量PCR技術(shù)的產(chǎn)生技術(shù)的產(chǎn)生1992年由年由Higuchi等人第一次報(bào)告：使用等人第一次報(bào)告：使用EB加入加入PCR反應(yīng)體系，經(jīng)改裝的帶有冷反應(yīng)體系，經(jīng)改裝的帶有冷CCD的的PCR儀檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度儀檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度核酸核酸 染料熒光染料熒光后來(lái)用與雙鏈后來(lái)用與雙鏈DNA有更強(qiáng)結(jié)合力的有更強(qiáng)結(jié)合力的SYBR Green I取代取代EB 熒光定量熒光定量PCR基本原理基

2、本原理Real-time ChemistriesPCR的理論方程：的理論方程：Y=x(1+ Ev)n Y：擴(kuò)增物數(shù)量；：擴(kuò)增物數(shù)量； X ：起始模板數(shù)量；：起始模板數(shù)量；Ev：擴(kuò)增效率；：擴(kuò)增效率；n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)1. 終點(diǎn)法定量原理終點(diǎn)法定量原理前提：在最佳實(shí)驗(yàn)、循環(huán)次數(shù)前提：在最佳實(shí)驗(yàn)、循環(huán)次數(shù)n一定、一定、Ev相同相同原理：根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的量計(jì)數(shù)反應(yīng)物中原始分子數(shù)，即：原理：根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的量計(jì)數(shù)反應(yīng)物中原始分子數(shù)，即：lnx=lnY-nln(1+Ev)=lnY - b (b為常數(shù)為常數(shù))2. 實(shí)時(shí)檢測(cè)法定量原理實(shí)時(shí)檢測(cè)法定量原理前提：在最佳實(shí)驗(yàn)、相同前提：在最佳實(shí)驗(yàn)、相同Ev以、擴(kuò)

3、增產(chǎn)物量相同以、擴(kuò)增產(chǎn)物量相同原理：反應(yīng)物中原始分子數(shù)原理：反應(yīng)物中原始分子數(shù)X與其所需要的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)與其所需要的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)n成反比，由此計(jì)算出標(biāo)本中靶分子的準(zhǔn)確含量，即：成反比，由此計(jì)算出標(biāo)本中靶分子的準(zhǔn)確含量，即：LgX=LgYnLg(1+Ev)=b - na (a、b為常數(shù)為常數(shù)) 熒光定量熒光定量PCR的定量原理的定量原理閾值：閾值：PCR擴(kuò)增信號(hào)進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)擴(kuò)增信號(hào)進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)的熒光值。定的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)的熒光值。閾值閾值threshold的設(shè)定的設(shè)定PCR efficiency=10(-1/slope)-1Where slope=1/mSlope -3.322100%

4、efficiencyPCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。Ct值值n：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù) n: 擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的確定擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的確定logN=log N0 +nlogE n=Ct每個(gè)模板的每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系。利用已知起始拷貝值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知樣品的數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知樣品的Ct值，即可計(jì)算出該樣品的起始拷貝值，即可計(jì)算出該樣品的起

5、始拷貝數(shù)。數(shù)。 Ct值與起始模板的關(guān)系值與起始模板的關(guān)系Y軸Ct值X起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線由系列稀釋的已知濃度的樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線由系列稀釋的已知濃度的樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板濃度計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板濃度log N0 =-Ct logE+logN 絕對(duì)定量絕對(duì)定量未知濃度的樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較未知濃度的樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較l 內(nèi)摻式染料內(nèi)摻式染料 SYBR Green I, LC Greenl 序列特異性探針序列特異性探針 Taqman l Molecular Beaconsl FRETl 引物特異性探針引物特異性探針Amplifluor (Intergen)l LUX 熒

6、光定量熒光定量 PCR 標(biāo)記方法標(biāo)記方法5353SGExcitationSGSGSGSGEmission5353SGSGSGSGSGExcitationEmissionRQ53535353ExcitationRQQRQRExcitationRQExcitationRQQRExcitationEmissionOligo 1: FluoresceinOligo 2: LC Red 640ExcitationEmissionTransfer 熒光定量熒光定量PCR不同方法學(xué)的應(yīng)用不同方法學(xué)的應(yīng)用 研究目的研究目的 標(biāo)記方法標(biāo)記方法l 定量分析基因拷貝數(shù)的絕對(duì)定量，基因表達(dá)調(diào)控的相對(duì)定量）定量分析基因

7、拷貝數(shù)的絕對(duì)定量，基因表達(dá)調(diào)控的相對(duì)定量）l Sybr-Green (LC Green), Taqman, Molecular Beacon, etc 研究目的l 基因型分析基因型分析SNP、突變型分析）、突變型分析）l Taqman, Molecular Beacon, FRET, LC Greenl 熔解曲線分析熔解曲線分析l Sybr-Green, LC Green, Molecular Beacon, FRET某科研用戶(hù)使用Rotor-Gene 3000進(jìn)行基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 （自備標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)樣品做復(fù)管）l 絕對(duì)定量絕對(duì)定量某科研用戶(hù)使用Rotor-Gene 3000進(jìn)行基因表達(dá)相對(duì)定

8、量分析，下圖為用Ct法得出的分析結(jié)果 。（自備標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)樣品做3次重復(fù)復(fù)管）HouseKeeper GeneGene of Interestl 相對(duì)定量相對(duì)定量利用溶解曲線進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化RG3000）l 熔解曲線分析熔解曲線分析deg.737475767778798081828384858687888990919293949596979899100dF/dT.35.3.25.2.15.1.05Bin ABin BAnnealing at 60deg.737475767778798081828384858687888990919293949596979899100dF/dT1.21.11.

9、9.8.7.6.5.4.3.2.10Bin AAnnealing at 63 標(biāo)記方法標(biāo)記方法l Taqmanl 定量分析，基因型分析l Sybr-Greenl 定量分析，熔解曲線分析，基因型分析 (LC Green)l Molecular Beaconl 定量分析，熔解曲線分析，基因型分析l FRETl 定量分析，熔解曲線分析，基因型分析l Ampliflour Probe，LUXl 定量分析 基因型分析基因型分析l 利用擴(kuò)增信號(hào)的種類(lèi)來(lái)分型利用擴(kuò)增信號(hào)的種類(lèi)來(lái)分型 Taqmanl 根據(jù)熔解曲線的不同來(lái)分型根據(jù)熔解曲線的不同來(lái)分型 FRET, Molecular Beaconl LC Gre

10、en雙Taqman探針?lè)z測(cè)野生型和突變型 在基因型分析中，可采用兩種不同的Taqman探針?lè)謩e針對(duì)野生型和突變型)，即一個(gè)突變型探針以一種熒光素Flr標(biāo)志，而野生型探針則用不同的熒光物Tet標(biāo)志。如果只有一種信號(hào)被擴(kuò)增出來(lái)，則樣本為對(duì)應(yīng)的基因型野生型或突變型的純合子；如二者都被有效地?cái)U(kuò)增出來(lái)，則樣本為雜合型。l 利用擴(kuò)增信號(hào)的種類(lèi)來(lái)分型利用擴(kuò)增信號(hào)的種類(lèi)來(lái)分型雜合型野生型突變型 FRET探針進(jìn)行熔解曲線分析確定基因型 FRET探針與模板結(jié)合時(shí)，因共振能量的傳遞而信號(hào)增強(qiáng)，而當(dāng)在Tm 值時(shí)，F(xiàn)RET探針與PCR產(chǎn)物分開(kāi)，熒光信號(hào)減弱。通過(guò)實(shí)時(shí)捕捉到的PCR產(chǎn)物在熔解過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，得到PCR產(chǎn)物的熔解曲線。因?yàn)榘l(fā)生基因突變的PCR產(chǎn)物有特定的Tm 值，通過(guò)測(cè)定探針與PCR產(chǎn)物分開(kāi)時(shí)的熔解溫度Tm值，就能確定樣品的基因型。l 利用熔解曲線檢測(cè)基因突變利用熔解曲線檢測(cè)基因突變雜合型野生型突變型利用內(nèi)摻式染料進(jìn)行高分辨率熔解曲線HRM分析基因型HRM根據(jù)序列長(zhǎng)度、GC含量和互補(bǔ)性分析樣品，可