Western Blot快速實驗攻略

1、Western Blot 快速實驗攻略一、 Western Blot 實驗原理蛋白免疫印跡(Western Blot , WB 是將蛋白質(zhì)經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到膜上,然后利用抗體進行檢測的技術(shù)。完整的 WB 流程,如下圖所示,包含樣本制備、 SDS-PAGE 、轉(zhuǎn)膜、抗體結(jié)合、蛋白檢測等 5個大步驟。 二、試劑準備1. 各類緩沖液1電泳緩沖液:10xTris-Glycine-SDS 電泳緩沖液(20319ES76 2電轉(zhuǎn)緩沖液:Western Blot 電泳電轉(zhuǎn)通用緩沖液(20329ES03 3蛋白上樣緩沖液:5Xsds-PAGE 蛋白上樣緩沖液(20315ES05 4其他緩沖液:PBS , TB

2、ST 2. 樣本制備1細胞裂解液:RIPA (20101ES60,或 20115ES60,或 20114ES60 2蛋白酶抑制劑:PMSF (20104ES03 3. 蛋白定量1蛋白定量試劑:BCA 蛋白定量試劑盒(20201ES76 4. 蛋白電泳1預(yù)制膠:4-20%梯度預(yù)制膠, 12孔(36214ES102蛋白 marker :三色預(yù)染蛋白分子標準(10-245kDa (20352ES76 5. 轉(zhuǎn)膜與封閉 1膜(自備2膜上蛋白檢測:麗春紅染色液(36221ES60 3膜的封閉:BSA ,無 IgG (36103ES256. 抗體孵育1抗體:內(nèi)參抗體、一抗、二抗(例:30101ES10,

3、30401ES10, 34101ES602檢測試劑:ECL 化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒(36208ES60三、實驗步驟1. 樣本制備1融解 RIPA 裂解液,混勻。取適當量的裂解液,在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入 PMSF ,使 PMSF 的最終濃度為 1mM 。2貼壁細胞:去除培養(yǎng)液,用 PBS 、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。按照 6孔板每孔加入 150-250L裂解液的比例加入 裂解液。用槍吹打數(shù)下,使裂解液和細胞充分接觸。細胞充分裂解后應(yīng)無沒有明顯的細胞沉淀。懸浮細胞:離心收集細胞,用手指把細胞用力彈散。按照 6孔板每孔細胞加入 150-250L裂解液的比例加入裂解液。再 用手指輕彈以充分裂解細胞。

4、充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多,必需分裝成 0.5-1×106個細胞 /管,然后 再裂解。組織樣本:按照每 20mg 組織加入 150-250L裂解液的比例加入裂解液。用玻璃勻漿器勻漿,直至充分裂解。3充分裂解后, 10000-14000g 離心 3-5min ,取上清,即可進行后續(xù)的 PAGE 、 Western 和免疫沉淀等操作?！咀ⅰ?:RIPA 裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團透明膠狀物,屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組 DNA 等復(fù)合 物。在不檢測和基因組 DNA 結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下,可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗;如果需要檢測和基因組結(jié) 合特

5、別緊密的蛋白, 則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物, 隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。 如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄 因子,例如 NF-kappaB 、 p53 等時,通常不必進行超聲處理,就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。2. 蛋白定量1配制 BSA 標準品體系標準品稀釋液為蛋白樣品的溶解液, 原則上蛋白樣品在什么溶液中, 標準品也宜用什么溶液稀釋。 但也可用 0.9%的 NaCl 或 1×PBS進行稀釋。 BSA 標準品體系配制可參考下表。表 1BSA 標準品體系配制(微孔板檢測,線性范圍 20-2000g/mL *Vial 稀釋液體積 (L2mg/mLBSA 體積 (LBSA 終濃度 (g/

6、mLA 01002000B 25751500C 50501000D 12575750E 15050500F 35050250G 37525125H 395525I 40000=Blank*如用比色皿檢測,每管需加 100L 標準品,按 3個重復(fù)計算,每個濃度至少需配制 300L。2各取 25L標準品和待測樣品加入到微孔板中。3每孔加入 200LBCA 工作液,振蕩 30s 充分混勻。蓋上微孔板, 37 孵育 30min 。4冷卻到室溫,在酶標儀上的 540-595nm 波長范圍處檢測吸光度,其中 562nm 波長為最佳。5根據(jù) BSA 標準品的吸光度(減去標準品中空白孔的 OD 值即最終的讀數(shù)

7、 ,繪制標準曲線(X-蛋白濃度 ug/mL; Y-最終 的 OD562nm 。依據(jù)標準曲線和樣品的稀釋倍數(shù)計算樣品蛋白濃度。3. 蛋白電泳1剪開包裝取出預(yù)制膠,撕去膠板底端橙色膠紙,將預(yù)制膠固定在電泳槽中,內(nèi)槽加滿 tris-glycine 電泳緩沖液,外槽液面 低于內(nèi)槽 5-10mm ,雙手按住梳子左右部位將其平穩(wěn)緩慢(一定要慢,否則會將膠齒拔斷或拔歪拔出。2在室溫或不超過 37 的水浴中溶解 5×SDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。3按照每 4L蛋白樣品加入 1l5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液的比例,混合蛋白樣品和 5×SDS-PAGE蛋白

8、上樣緩沖液。4 100 或沸水浴加熱 3-5min ,以充分變性蛋白,之后冷卻至室溫備用。5在每個樣品孔中上樣 20-40µg蛋白,并在 1個孔中上樣蛋白 marker ,蓋上電泳槽蓋,打開電源,推薦使用低壓 100V ,跑 15min ,之后換高壓 150V 跑,通常電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。6電泳后取出膠板,用鑷子或小螺絲刀沿左右兩板間的縫隙將兩板別開,掰開兩板,將膠取出,棄去塑料板,此時蛋白會 從凝膠上慢慢擴散,因此不要保存在凝膠里,要迅速進行下一步的轉(zhuǎn)移操作。4. 轉(zhuǎn)膜與封閉1將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡 5min 。 (如果檢測小分子蛋白質(zhì),可省略該步

9、驟,因小分子蛋白容易擴散 。2依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙 6片,放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡 10min ,如用 PVDF 膜,需參照說明書,先用純甲醇浸 泡 1-2min ,再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。 (膜的選擇:0.45m孔徑,用于一般蛋白; 0.2m孔徑,用于分子量小于 20kD 蛋白; 0.1m孔徑,用于分子量小于 7kD 蛋白。 3裝配轉(zhuǎn)移三明治:海綿 /3層濾紙 /膠 /膜 /3層濾紙 /海綿,每層放好后,用試管趕盡氣泡。4 將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中, 放入三明治, 膜靠近陽極, 膠靠近陰極, 加入轉(zhuǎn)移緩沖液, 插上電極, 100V , 1h (電流約為 0.3A 。5轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,切斷電源

10、,取出膜。6將膜浸沒在 5mL 麗春紅染色液中,置于軌道搖床上室溫染色 510min或更長,直待膜上顯示出蛋白條帶。注:如果沒有 出現(xiàn)染色條帶,則表示轉(zhuǎn)膜失敗,可能需要重新轉(zhuǎn)膜或重新上樣電泳。7清洗:取出膜,用蒸餾水, PBS 或者其他適當溶液沖洗至背景清晰后拍照,大概沖洗 23次,每次 5min 。8脫色:將膜放到 0.1N NaOH 溶液漂洗 5min ;倒去洗脫液,再重復(fù)一次。9清洗:再用蒸餾水清洗膜 23次,每次 5min 。10將膜置于 25mL 封閉緩沖液中,在室溫下孵育 1小時。 11用 5mL TBST 洗滌三次,每次 15min。 5. 抗體孵育與檢測1將膜和一抗(按照產(chǎn)品應(yīng)

11、用推薦稀釋度置于 10mL 一抗稀釋緩沖液中在 4°C下孵育過夜并不時輕輕晃動。 2用 5mL TBST 洗滌三次,每次 15min 以去除殘留的一抗。3將膜和二抗(按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度置于 10mL 封閉緩沖液中孵育 1-2小時并不時輕輕晃動。 4用 5mL TBST 洗滌三次,每次 15min 。5最后一次洗膜的同時,按照 ECL 超敏試劑盒說明書,新鮮配制發(fā)光工作液。6用平頭鑷取出膜,搭在濾紙上瀝干洗液,勿使膜完全干燥。將膜完全浸入發(fā)光工作液(125L發(fā)光工作液 /cm2膜中, 與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育 3min ,準備立即壓片曝光。 7用鑷子夾起膜,搭在濾紙上瀝干發(fā)光工作液。但勿洗去發(fā)光液。8在 X 光膠片暗盒內(nèi)表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將印跡膜貼在保鮮膜上,將保鮮膜折起來完全包裹印跡膜,