微生物細(xì)胞的破碎ppt課件

1、第三章、微生物細(xì)胞的破碎l微生物的代謝產(chǎn)物有的分泌到細(xì)胞或組織之外，微生物的代謝產(chǎn)物有的分泌到細(xì)胞或組織之外，稱(chēng)為胞外產(chǎn)物。稱(chēng)為胞外產(chǎn)物。( (例如細(xì)菌產(chǎn)生的堿性蛋白酶，霉例如細(xì)菌產(chǎn)生的堿性蛋白酶，霉菌產(chǎn)生的糖化酶等菌產(chǎn)生的糖化酶等) )l還有許多是存在于細(xì)胞內(nèi)還有許多是存在于細(xì)胞內(nèi)( (例如青霉素?；福瑝A例如青霉素?；福瑝A性磷酸酯酶等性磷酸酯酶等) )稱(chēng)為胞內(nèi)產(chǎn)物。稱(chēng)為胞內(nèi)產(chǎn)物。l對(duì)于胞外產(chǎn)物只需直接將發(fā)酵液預(yù)處置及過(guò)濾，對(duì)于胞外產(chǎn)物只需直接將發(fā)酵液預(yù)處置及過(guò)濾，獲得廓清的濾液，作為進(jìn)一步純化的出發(fā)原液，獲得廓清的濾液，作為進(jìn)一步純化的出發(fā)原液，l對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物，那么需首先搜集菌體進(jìn)展細(xì)胞

2、破對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物，那么需首先搜集菌體進(jìn)展細(xì)胞破碎，使代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)入液相中，然后，再進(jìn)展細(xì)胞碎，使代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)入液相中，然后，再進(jìn)展細(xì)胞碎片的分別。碎片的分別。 細(xì)胞壁的組成和構(gòu)造細(xì)胞壁的組成和構(gòu)造l 細(xì)胞破碎是為了破壞細(xì)胞外圍使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來(lái)。微生物的細(xì)胞外圍通常包括細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。 l 細(xì)胞膜使細(xì)胞內(nèi)外堅(jiān)持一定的濃度差，它主要由蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成，強(qiáng)度比較差，易受浸透壓沖擊而破碎。細(xì)胞破碎的主要阻力來(lái)自于細(xì)胞壁。細(xì)菌的細(xì)胞壁細(xì)菌的細(xì)胞壁l 幾乎一切細(xì)菌的細(xì)胞壁都是由鞏固的骨架肽聚糖組成，是由肽聚糖鏈借短肽交聯(lián)而成，使細(xì)胞具有一定的外形和強(qiáng)度。l短肽普通由四或五個(gè)氨基酸組成，如L丙氮酸D谷氨酸L賴(lài)

3、氨酸D丙氨酸。l肽聚糖鍵是N乙酰葡萄糖胺和N乙酰胞壁酸交替地經(jīng)過(guò)l4糖苷鍵聯(lián)接而成。短肽接在N乙酰胞壁酸上，相鄰的短肽又交叉相聯(lián)，構(gòu)成了網(wǎng)狀構(gòu)造。革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁l革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁較厚革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁較厚151550 nm50 nm，肽聚，肽聚糖占糖占4040一一9090，其他是多糖和磷壁酸，其他是多糖和磷壁酸，l 革蘭氏陰性菌的肽聚糖層較薄革蘭氏陰性菌的肽聚糖層較薄1.51.52.0nm2.0nm，最外面還有一較厚的外壁層最外面還有一較厚的外壁層810 nm810 nm，外壁，外壁層主要由脂蛋白，脂多糖組成。層主要由脂蛋白，脂多糖組成。l 破碎細(xì)菌的主要阻力是來(lái)自于肽聚糖的網(wǎng)狀構(gòu)

4、造，破碎細(xì)菌的主要阻力是來(lái)自于肽聚糖的網(wǎng)狀構(gòu)造，其網(wǎng)構(gòu)造的致密程度和強(qiáng)度取決于聚糖鏈上所存其網(wǎng)構(gòu)造的致密程度和強(qiáng)度取決于聚糖鏈上所存在的膚鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度，假設(shè)交聯(lián)程度在的膚鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度，假設(shè)交聯(lián)程度大，那么網(wǎng)構(gòu)培育致密。大，那么網(wǎng)構(gòu)培育致密。酵母菌的細(xì)胞壁酵母菌的細(xì)胞壁l主要成分為葡聚糖與甘露聚糖以及蛋白質(zhì)等，比主要成分為葡聚糖與甘露聚糖以及蛋白質(zhì)等，比革蘭氏陽(yáng)性菌稍厚，而且其厚度隨菌齡添加而添革蘭氏陽(yáng)性菌稍厚，而且其厚度隨菌齡添加而添加。加。l細(xì)胞壁的最里層是由葡聚糖的細(xì)纖維組成，它構(gòu)細(xì)胞壁的最里層是由葡聚糖的細(xì)纖維組成，它構(gòu)成了細(xì)胞壁的剛性骨架，使細(xì)胞具有一定的外形成了細(xì)

5、胞壁的剛性骨架，使細(xì)胞具有一定的外形l覆蓋在細(xì)纖維上面的是一層糖蛋白，覆蓋在細(xì)纖維上面的是一層糖蛋白，l再外面是由再外面是由1 1，6 6磷酸二酯鍵共價(jià)銜接而成網(wǎng)狀磷酸二酯鍵共價(jià)銜接而成網(wǎng)狀構(gòu)造的甘露聚糖。有甘露聚糖酶的復(fù)合物，它構(gòu)造的甘露聚糖。有甘露聚糖酶的復(fù)合物，它可以共價(jià)銜接到網(wǎng)狀構(gòu)造上，也可以不銜接。可以共價(jià)銜接到網(wǎng)狀構(gòu)造上，也可以不銜接。真菌的細(xì)胞壁真菌的細(xì)胞壁l大多數(shù)真菌的多糖壁，主要存在三種聚合大多數(shù)真菌的多糖壁，主要存在三種聚合物，葡聚糖主要以物，葡聚糖主要以1313鍵銜接，鍵銜接，某些以某些以l6l6鍵銜接，幾丁質(zhì)鍵銜接，幾丁質(zhì)以微纖維形狀存在以微纖維形狀存在, ,糖蛋白。糖

6、蛋白。l真菌細(xì)胞壁的強(qiáng)度和聚合物的網(wǎng)狀構(gòu)造有真菌細(xì)胞壁的強(qiáng)度和聚合物的網(wǎng)狀構(gòu)造有關(guān)關(guān)l它還含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀構(gòu)造，它還含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀構(gòu)造，所以強(qiáng)度有所提高。所以強(qiáng)度有所提高。細(xì)胞壁的構(gòu)造和細(xì)胞的破碎細(xì)胞壁的構(gòu)造和細(xì)胞的破碎l破碎細(xì)胞，必需抑制的主要阻力是網(wǎng)狀構(gòu)破碎細(xì)胞，必需抑制的主要阻力是網(wǎng)狀構(gòu)造的共價(jià)鍵。造的共價(jià)鍵。l在用酶法或化學(xué)法來(lái)溶解細(xì)胞壁時(shí)，細(xì)胞在用酶法或化學(xué)法來(lái)溶解細(xì)胞壁時(shí)，細(xì)胞壁的構(gòu)造和組成顯得特別重要，可用來(lái)作壁的構(gòu)造和組成顯得特別重要，可用來(lái)作為選擇溶菌酶和化學(xué)方法的根據(jù)。為選擇溶菌酶和化學(xué)方法的根據(jù)。 微生物細(xì)胞的破碎技術(shù)機(jī)械方法球磨機(jī) 高壓勻漿器 X-

7、press法 超聲波破碎 非機(jī)械方法 酶解浸透壓沖擊凍結(jié)和融化枯燥法化學(xué)法l球磨機(jī)球磨機(jī)l 研磨是常用的一種方法，它將細(xì)胞懸浮研磨是常用的一種方法，它將細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一同快速液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一同快速攪拌或研磨，使到達(dá)細(xì)胞的某種程度破碎。攪拌或研磨，使到達(dá)細(xì)胞的某種程度破碎。這些安裝的主要缺陷是在破碎期間樣品溫這些安裝的主要缺陷是在破碎期間樣品溫度迅速升高，經(jīng)過(guò)用二氧化碳來(lái)冷卻容器度迅速升高，經(jīng)過(guò)用二氧化碳來(lái)冷卻容器可得到部分處理?？傻玫讲糠痔幚?。球磨機(jī)球磨機(jī)l高壓勻漿器高壓勻漿器l 采用高壓勻漿器采用高壓勻漿器是大規(guī)模破碎細(xì)胞的是大規(guī)模破碎細(xì)胞的常用方法，利用

8、高壓常用方法，利用高壓迫使細(xì)胞懸浮液經(jīng)過(guò)迫使細(xì)胞懸浮液經(jīng)過(guò)針形閥，由于忽然減針形閥，由于忽然減壓和高速?zèng)_擊撞擊環(huán)壓和高速?zèng)_擊撞擊環(huán)呵斥細(xì)胞破裂呵斥細(xì)胞破裂高壓勻漿法 l適用于酵母菌、大腸桿菌、宏大芽孢桿菌適用于酵母菌、大腸桿菌、宏大芽孢桿菌和黑曲霉等。不適用于高度分枝的微生物。和黑曲霉等。不適用于高度分枝的微生物。 X-press法法一種改良的高壓方法是將濃縮的菌體一種改良的高壓方法是將濃縮的菌體懸浮液冷卻至懸浮液冷卻至-25C至至-30 C構(gòu)成冰晶構(gòu)成冰晶體，利用體，利用500 MPa以上的高壓沖擊，以上的高壓沖擊，冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。細(xì)胞冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。細(xì)胞破碎是由于冰

9、晶體的磨損，包埋在冰破碎是由于冰晶體的磨損，包埋在冰中的微生物的變形所引起的。中的微生物的變形所引起的。該法的優(yōu)點(diǎn)是適用的范圍廣，破碎率該法的優(yōu)點(diǎn)是適用的范圍廣，破碎率高，細(xì)胞碎片的粉碎程度低以及活性高，細(xì)胞碎片的粉碎程度低以及活性的保管率高，的保管率高，該法對(duì)冷凍該法對(duì)冷凍融解敏感的生化物質(zhì)不融解敏感的生化物質(zhì)不適用。適用。 超聲波法細(xì)胞的破碎是由于超聲波的空穴作用，從而產(chǎn)生一個(gè)極為劇烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性旋渦在介質(zhì)中的懸浮細(xì)胞上呵斥了剪切應(yīng)力，促使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動(dòng)，從而使細(xì)胞破碎。對(duì)于不同菌種的發(fā)酵液、超聲波處置的效果不同，桿菌比球菌易破碎、革蘭氏陰性菌細(xì)胞比革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞容

10、易破碎，對(duì)酵母菌的效果級(jí)差。該法不適于大規(guī)模操作，由于放大后，要輸入很高的能量來(lái)提供必要的冷卻，這是困難的。超聲波破碎儀酶解法l利用酶反響，分解破壞細(xì)胞壁上特殊的鍵，利用酶反響，分解破壞細(xì)胞壁上特殊的鍵，從而到達(dá)破壁的目的。從而到達(dá)破壁的目的。l優(yōu)點(diǎn)：專(zhuān)注性強(qiáng)，發(fā)生酶解的條件溫暖。優(yōu)點(diǎn)：專(zhuān)注性強(qiáng)，發(fā)生酶解的條件溫暖。l缺陷：酶水解費(fèi)用較貴，普通只適用于小缺陷：酶水解費(fèi)用較貴，普通只適用于小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室研討。規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室研討。l溶菌酶是運(yùn)用最多的酶，它能專(zhuān)注地分解溶菌酶是運(yùn)用最多的酶，它能專(zhuān)注地分解細(xì)胞壁上糖蛋白分子的細(xì)胞壁上糖蛋白分子的-1-1，4 4糖苷鍵，使糖苷鍵，使脂多糖解離，經(jīng)溶菌酶處

11、置后的細(xì)胞移至脂多糖解離，經(jīng)溶菌酶處置后的細(xì)胞移至低滲溶液中使細(xì)胞破裂低滲溶液中使細(xì)胞破裂自溶作用自溶作用l是酶解的另一種方法，所需溶胞的酶是由是酶解的另一種方法，所需溶胞的酶是由微生物本身產(chǎn)生的。微生物本身產(chǎn)生的。l影響自溶過(guò)程的要素有溫度、時(shí)間、影響自溶過(guò)程的要素有溫度、時(shí)間、pHpH緩緩沖液濃度、細(xì)胞代謝途徑等。沖液濃度、細(xì)胞代謝途徑等。l自溶法在一定程度上能用于工業(yè)規(guī)模，但自溶法在一定程度上能用于工業(yè)規(guī)模，但是，對(duì)不穩(wěn)定的微生物容易引起所需蛋白是，對(duì)不穩(wěn)定的微生物容易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后的細(xì)胞培育液過(guò)濾速度質(zhì)的變性，自溶后的細(xì)胞培育液過(guò)濾速度也會(huì)降低。也會(huì)降低。 浸透壓沖擊l是

12、較溫暖的一種破碎方法，將細(xì)胞放在高是較溫暖的一種破碎方法，將細(xì)胞放在高浸透壓的介質(zhì)中浸透壓的介質(zhì)中( (如一定濃度的甘油或蔗糖如一定濃度的甘油或蔗糖溶液溶液) )，入到達(dá)平衡后，介質(zhì)被忽然稀釋?zhuān)氲竭_(dá)平衡后，介質(zhì)被忽然稀釋?zhuān)蛘邔⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于浸透或者將細(xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于浸透壓的忽然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起壓的忽然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞壁的破裂。細(xì)胞壁的破裂。l浸透壓沖擊的方法僅對(duì)細(xì)胞壁較脆弱的菌，浸透壓沖擊的方法僅對(duì)細(xì)胞壁較脆弱的菌，或者細(xì)胞壁預(yù)先用酶處置，或合成受抑制或者細(xì)胞壁預(yù)先用酶處置，或合成受抑制而強(qiáng)度減弱時(shí)才是適宜的。而強(qiáng)度減弱時(shí)才是適宜的。 凍結(jié)

13、-融化法l將細(xì)胞放在低溫下忽然冷凍和室溫下融化，將細(xì)胞放在低溫下忽然冷凍和室溫下融化，反復(fù)多次而到達(dá)破壁作用。反復(fù)多次而到達(dá)破壁作用。l對(duì)于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。對(duì)于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。但通常破碎率很低即使反復(fù)循環(huán)多次也不但通常破碎率很低即使反復(fù)循環(huán)多次也不能提高收率。能提高收率。l另外，還能夠引起對(duì)凍融敏感的某些蛋白另外，還能夠引起對(duì)凍融敏感的某些蛋白質(zhì)的變性。質(zhì)的變性?？菰锓╨可采用空氣枯燥，真空枯燥，噴霧枯燥和可采用空氣枯燥，真空枯燥，噴霧枯燥和冷凍枯燥等。冷凍枯燥等。l空氣枯燥主要適用于酵母菌。真空枯燥適空氣枯燥主要適用于酵母菌。真空枯燥適用于細(xì)菌的枯燥。冷凍枯燥

14、適用于較不穩(wěn)用于細(xì)菌的枯燥。冷凍枯燥適用于較不穩(wěn)定的生化物質(zhì)。定的生化物質(zhì)。l枯燥法條件變化較猛烈，容易引起蛋白質(zhì)枯燥法條件變化較猛烈，容易引起蛋白質(zhì)或其它組織變性?；蚱渌M織變性?；瘜W(xué)法l用酸堿及外表活性劑處置，可以使蛋白質(zhì)用酸堿及外表活性劑處置，可以使蛋白質(zhì)水解，細(xì)胞溶解或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲水解，細(xì)胞溶解或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來(lái)。漏出來(lái)。l某些脂溶性溶劑也能作為化學(xué)處置的方法，某些脂溶性溶劑也能作為化學(xué)處置的方法，如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等。但是，這如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等。但是，這些試劑容易引起生化物質(zhì)破壞，還會(huì)帶來(lái)些試劑容易引起生化物質(zhì)破壞，還會(huì)帶來(lái)分別和回收化學(xué)物質(zhì)的問(wèn)題。分

15、別和回收化學(xué)物質(zhì)的問(wèn)題。 破碎方法的選擇l選擇適宜的破碎方法需求思索以下要素：選擇適宜的破碎方法需求思索以下要素：l細(xì)胞的數(shù)量；細(xì)胞的數(shù)量；l所需求的產(chǎn)物對(duì)破碎條件所需求的產(chǎn)物對(duì)破碎條件(溫度、化學(xué)試劑、溫度、化學(xué)試劑、酶等酶等)的敏感性；的敏感性；l要到達(dá)的破碎程度及破碎所必要的速度，要到達(dá)的破碎程度及破碎所必要的速度，l盡能夠采用最溫暖的方法；盡能夠采用最溫暖的方法；l具有大規(guī)模運(yùn)用潛力的生化產(chǎn)品應(yīng)選擇適具有大規(guī)模運(yùn)用潛力的生化產(chǎn)品應(yīng)選擇適宜于放大的破碎技術(shù)。宜于放大的破碎技術(shù)。 破碎率的評(píng)價(jià)破碎率的評(píng)價(jià) l破碎率的評(píng)價(jià)破碎率的評(píng)價(jià)l細(xì)胞破碎率定義為被破碎細(xì)胞的數(shù)量占原始細(xì)胞細(xì)胞破碎率定義

16、為被破碎細(xì)胞的數(shù)量占原始細(xì)胞數(shù)量的百分比數(shù)，即：數(shù)量的百分比數(shù)，即：l Y(%)=(N0-N)/N0100lN0原始細(xì)胞數(shù)量原始細(xì)胞數(shù)量 lN經(jīng)經(jīng)t時(shí)間操作后保管下來(lái)的未損害完好細(xì)胞數(shù)時(shí)間操作后保管下來(lái)的未損害完好細(xì)胞數(shù)量量l 目前目前N0和和N主要經(jīng)過(guò)下面的方法獲得主要經(jīng)過(guò)下面的方法獲得 各種破碎方法的評(píng)述各種破碎方法的評(píng)述 l高壓均漿和珠磨兩種機(jī)械破碎方法，處置高壓均漿和珠磨兩種機(jī)械破碎方法，處置量大，速度非?？?，目前在工業(yè)生長(zhǎng)上運(yùn)量大，速度非?？?，目前在工業(yè)生長(zhǎng)上運(yùn)用最廣泛。但在機(jī)械法破碎過(guò)程中，容易用最廣泛。但在機(jī)械法破碎過(guò)程中，容易產(chǎn)生大量的熱量，使料液溫度升高，而易產(chǎn)生大量的熱量，

17、使料液溫度升高，而易呵斥生化物質(zhì)的破壞，特別是在超聲波處呵斥生化物質(zhì)的破壞，特別是在超聲波處置時(shí)。因此，超聲波振蕩法主要適用于實(shí)置時(shí)。因此，超聲波振蕩法主要適用于實(shí)驗(yàn)室或小規(guī)模的細(xì)胞破碎。驗(yàn)室或小規(guī)模的細(xì)胞破碎。l 各種破碎方法的評(píng)述各種破碎方法的評(píng)述 l非機(jī)械法普通僅適用于小規(guī)模運(yùn)用。浸透壓沖擊和凍結(jié)融解法都屬于較溫暖的方法，但破碎作用較弱它們常與酶解法結(jié)合起來(lái)運(yùn)用，提高破碎效果?？菰锓▽儆谳^猛烈的一種破碎方法，容易引起蛋白質(zhì)或其它組分變性. 破碎方法的選擇根據(jù)破碎方法的選擇根據(jù)l處置量處置量l高壓勻漿和珠磨機(jī)處置量大，速度快，適用于工業(yè)消費(fèi)高壓勻漿和珠磨機(jī)處置量大，速度快，適用于工業(yè)消費(fèi)l產(chǎn)物對(duì)破碎條件溫度、化學(xué)試劑、酶等的敏感性以及產(chǎn)物對(duì)破碎條件溫度、化學(xué)試劑、酶等的敏感性以及產(chǎn)物在細(xì)胞中的位置產(chǎn)物在細(xì)胞中的位置l生化物質(zhì)的穩(wěn)定性生化物質(zhì)的穩(wěn)定性l細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞壁的強(qiáng)度細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞壁的強(qiáng)度l破碎程度破碎程度l提取分別的難易提取分別的難易l總之，適宜的細(xì)胞破碎條件應(yīng)該從高的產(chǎn)物釋放率、低的總之，適宜的細(xì)胞破碎條件應(yīng)該從高的產(chǎn)物釋放率、低的能耗和便于后續(xù)提取這三方面進(jìn)展權(quán)衡。能耗和便于后續(xù)提取這三方面進(jìn)展權(quán)