大鼠側(cè)腦室注射δ-阿片受體拮抗劑naltrindole或激動(dòng)劑TAN-67對(duì)急性腦缺血的影響

1、生理學(xué)報(bào) Acta Physiologica Sinica, August 25, 2008, 60 (4): 475-484475研究論文大鼠側(cè)腦室注射-阿片受體拮抗劑naltrindole或激動(dòng)劑TAN-67對(duì)急性腦缺血的影響田雪松1，周 飛1, 2，楊 茹1，夏 螢2, 3，吳根誠(chéng)1，郭景春1,*1復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中西醫(yī)結(jié)合系，上海200032；2上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究中心，上海201203；3美國(guó)耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院，紐海文CT 06520摘 要：本文旨在探討-阿片受體(-opioid receptor, DOR)在急性腦缺血/再灌注損傷中的作用。除假手術(shù)組外，其

2、余各組均用大腦中動(dòng)脈線栓法(middle cerebral artery occlusion, MCAO)制備大鼠右側(cè)局灶性缺血/再灌注模型，缺血1 h再灌注24 h。于缺血前30 min側(cè)腦室分別注射DOR拮抗劑naltrindole (20 nmol, 50 nmol, 100 nmol)、激動(dòng)劑TAN-67 (30 nmol, 60nmol, 200 nmol)或人工腦脊液，用Longa 5 分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，焦油紫(cresyl violet, CV)染色和圖像分析處理系統(tǒng)測(cè)量梗死灶大小，Western blot 檢測(cè)紋狀體DOR蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，60 nmol

3、TAN-67顯著減小梗死體積(P<0.05)，提高神經(jīng)功能缺損評(píng)分(P<0.05)，約60 kDa 的DOR蛋白表達(dá)也傾向于上升(P>0.05)；100 nmol 的naltrindole加重腦缺血損傷，約60 kDa的DOR蛋白表達(dá)下降 (P<0.05)。上述結(jié)果提示，激動(dòng)DOR對(duì)急性缺血/再灌注大鼠的腦損傷有保護(hù)作用，而阻斷DOR則加重其損傷。關(guān)鍵詞：腦缺血；-阿片受體；TAN-67；naltrindole；大腦中動(dòng)脈栓塞中圖分類號(hào)：R743.3Effects of intracerebroventricular injection of -opioid recep

4、tor agonist TAN-67or antagonist naltrindole on acute cerebral ischemia in ratTIAN Xue-Song1, ZHOU Fei1,2, YANG Ru1, XIA Ying2,3, WU Gen-Cheng1, GUO Jing-Chun1,*1National Key Laboratory of Medical Neurobiology, Department of Integrative Medicine, Shanghai Medical College, FudanYale University School

5、of Medicine, New Haven, CT 06520, USAUniversity, Shanghai 200032, China; 2Shanghai Research Center for Acumoxibustion and Meridians, Shanghai 201203, China;3Abstract: This work was performed to determine the role of -opioid receptor (DOR) in protection against acute ischemia/reperfusioninjury. Trans

6、ient (1 h) focal cerebral ischemia was induced by middle cerebral artery occlusion (MCAO). DOR agonist TAN-67 (30nmol, 60 nmol, 200 nmol), DOR antagonist naltrindole (20 nmol, 50 nmol, 100 nmol) or artificial cerebral spinal fluid (aCSF) wasinjected respectively into the lateral cerebroventricle of

7、the rat 30 min before the induction of brain ischemia. Neurological deficits were assessedby the five-grade system (Longas methods). The brain infarct was measured by cresyl violet (CV) staining and infarct volume was analyzedby an image processing and analysis system. The expression of DOR was dete

8、cted by Western blot. The results showed that 60 nmolTAN-67 significantly reduced the infarct volume (P<0.05), attenuated neurological deficits (P<0.05) and tended to increase the expressionof about 60 kDa DOR protein (P>0.05), while 100 nmol naltrindole aggravated ischemic damage and decre

9、ased about 60 kDa DOR proteinexpression (P<0.05). These results suggest that DOR activation protects the brain against acute ischemia/reperfusion injury in rat.Key words: brain ischemia; -opioid receptor; TAN-67; naltrindole; middle cerebral artery occlusionReceived 2008-04-02 Accepted 2008-05-27

10、This work was supported by the National Basic Research Development Program of China (No. 2005CB523306), NationalNatural Science Foundation of China (No. 30670721), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (No. 06DZ19734,04DZ19836, 05DZ19745), The 6th Postgraduate Student Foundation

11、 of Fudan University and NIH (No. HD-34852).*Corresponding author. Tel: +86-21-54237231; E-mail: guojch476 生理學(xué)報(bào) Acta Physiologica Sinica, August 25, 2008, 60 (4): 475-484缺血性腦損傷(中風(fēng))是嚴(yán)重危害人類健康的常見疾病，迄今為止仍缺乏有效的防治措施。因此，尋找缺血性腦損傷的保護(hù)劑是刻不容緩的重要課題。早年曾有工作提示，阿片受體激動(dòng)劑或阻斷劑可影響缺血性腦損傷或者缺氧動(dòng)物的存活時(shí)間，但由于實(shí)驗(yàn)方法學(xué)的問題(如系統(tǒng)給予大劑量非特異

12、性激動(dòng)劑或阻斷劑)，所獲結(jié)果多有矛盾。有的顯示阿片受體激動(dòng)劑可起保護(hù)作用，另一些報(bào)道則提出相反的結(jié)論。近年來(lái)，多學(xué)科研究的直接證據(jù)提示，-阿片受體(-opioid receptor, DOR)對(duì)缺血缺氧神經(jīng)元有保護(hù)作用1-9。例如，DOR激動(dòng)劑(D-Ala2, D-Leu5 enkephalin, DADLE)可以減輕谷氨酸對(duì)培養(yǎng)的大腦皮層神經(jīng)元興奮性毒性損傷，這種保護(hù)作用可以被DOR特異性拮抗劑naltrindole完全阻斷；而激活-阿片受體(-opioid receptor, MOR)和-阿片受體(-opioid receptor, KOR)則對(duì)谷氨酸所致神經(jīng)元損傷無(wú)明顯保護(hù)作用7。DOR

13、激動(dòng)劑DADLE可減輕缺氧所致原代培養(yǎng)神經(jīng)元的損傷，其拮抗劑naltrindole則可加重神經(jīng)元的低氧損傷8。在針刺抗缺血性腦損傷的效應(yīng)中，DOR也起著重要作用9。這些工作7-9明確揭示，DOR是缺血缺氧時(shí)保護(hù)神經(jīng)元的一種膜蛋白。目前，此觀點(diǎn)已得到了普遍的認(rèn)同10-16。然而，亦有報(bào)道提出，DOR激動(dòng)劑DADLE對(duì)于前腦缺血所致海馬損傷并沒有保護(hù)作用17。因此，DOR對(duì)于整體動(dòng)物的缺血性腦損傷究竟起何作用，尚待進(jìn)一步確定。鑒此，本實(shí)驗(yàn)擬在大鼠側(cè)腦室分別注射DOR拮抗劑naltrindole和DOR激動(dòng)劑TAN-67，觀察DOR的激活或阻斷對(duì)急性局灶性腦缺血后神經(jīng)功能、腦梗死體積以及DOR蛋白表

14、達(dá)的影響，以明確DOR在缺血性腦損傷中的作用。1 材料與方法1.1 試劑儀器Naltrindole、DiI (Fluorescentdye1,19-dioctadecyl-6,69-di(4-sulfophenyl)-3,3,39, 39-tetramethylindocarbo cyanine)、Hoechst 33258和焦油紫(cresyl violet, CV)、HRP-抗鼠IgG、-actin單克隆抗體均購(gòu)自Sigma上海公司，兔多克隆抗DOR抗體1560、5505、抗兔Ig G- rodamin抗體、HRP-抗兔IgG購(gòu)自Chemicon公司，鼠抗MAP-2單克隆抗體和抗鼠IgG-

15、FITC抗體購(gòu)自Cell Signaling公司，ECL熒光顯影劑購(gòu)自Santa Cruz公司，水合氯醛(上海試劑一廠)，血?dú)夥治鰞x(990, AVL，瑞士)，Q570圖像分析系統(tǒng)(Leica, Germany)，立體定向儀(Narishige ST-7, Scientific Instrument Lab, Japan)，熒光顯微鏡(DM IRB, Leica, Germany)，激光多普勒血流儀(PeriFlux5000，瑞典Perimed公司)。1.2 動(dòng)物分組雄性Sprague-Dawley大鼠(中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，清潔級(jí))，體重(230±5) g，自由進(jìn)食，正常光

16、照。大鼠隨機(jī)分為8組：即假手術(shù)組(n=4)、單純腦缺血組(n=12)、腦缺血 + 20 nmol naltrindole組(n=12)、腦缺血 + 50nmol naltrindole組(n=12)、腦缺血 + 100 nmolnaltrindole組(n=12)、腦缺血 + 30 nmol TAN-67組(n=12)、腦缺血 + 60 nmol TAN-67組(n=12)、腦缺血 + 200 nmol TAN-67組(n=12)。1.3 側(cè)腦室注射及腦缺血處理大鼠固定于立體定向儀前囟高于后囟1 mm，參照大鼠腦圖譜18，在P0.2R1.4H4.0 (前囟后0.2 mm，旁開1.4 mm，深4

17、.0 mm)緩慢勻速(10 L/5 min)注射假手術(shù)組，單純腦缺血組注射10 L無(wú)菌人工腦脊液(artificial ce-rebral spinal fluid, aCSF)；TAN-67、naltrindole溶解于10 L無(wú)菌aCSF，留針10 min后緩慢拔針，然后迅速行大腦中動(dòng)脈線栓術(shù)(middle cerebral arteryocclusion, MCAO) (從藥物注射完成到MCAO成功共計(jì)30 min)，缺血1 h再灌注24 h。注射熒光染料DiI 2 L (2 mg/mL)以確定側(cè)腦室注射部位的準(zhǔn)確性。采用MCAO法阻塞大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈造成缺血。大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉(36

18、0 mg/kg體重，i.p.)，短暫性MCAO模型詳見本實(shí)驗(yàn)室以前文章所述19，簡(jiǎn)述如下：頸部正中切口，暴露右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈與頸外動(dòng)脈分叉處，將頭端燙圓的4-0號(hào)尼龍外科手術(shù)縫合線(美國(guó)Dermalon, Davis-Geck公司)插入至大腦中動(dòng)脈入口處，缺血1 h后退出尼龍線即為再灌注。術(shù)前禁食12 h，清醒后回籠，自由進(jìn)食。假手術(shù)組手術(shù)步驟同缺血組，但尼龍線不入顱。在整個(gè)手術(shù)期間，控制直腸溫度在(37±0.5) ºC范圍內(nèi)；應(yīng)用血?dú)夥治鰞x檢測(cè)血?dú)?PCO2、PO2和pH等)，分析大鼠生理狀態(tài)。1.4 皮層局部腦血流記錄大鼠水合氯醛麻醉后用骨鉆于前囟后1.5 mm，旁開4.5

19、 mm處(緊貼帽狀腱膜)鉆孔，暴露皮層，將激光多普勒血流儀配套的光纖探頭插入骨孔，固定探頭使其垂直正對(duì)皮層表面，記錄皮層局部腦血流的數(shù)值。每分鐘記錄一組穩(wěn)定腦血流值，從缺血前開始，連續(xù)記錄至田雪松等：大鼠側(cè)腦室注射-阿片受體拮抗劑naltrindole或激動(dòng)劑TAN-67對(duì)急性腦缺血的影響477再灌注30 min止。資料分析時(shí)，以缺血前的腦血流值為基礎(chǔ)血流值，計(jì)算缺血中以及再灌注后不同時(shí)程局部腦血流值所占的百分比。1.5 神經(jīng)功能缺損評(píng)分大鼠再灌注24 h時(shí)間點(diǎn)，觀察神經(jīng)功能缺損狀況。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)20：5分：輕提大鼠尾將其懸至距地面1 m處，雙前肢伸向地面且無(wú)其它神經(jīng)病學(xué)特征；4分：對(duì)側(cè)前肢持續(xù)彎

20、曲，程度由輕度前肢彎曲肩關(guān)節(jié)內(nèi)收到完全的前肢彎曲及肩關(guān)節(jié)內(nèi)旋；3分：將鼠置于軟塑封紙上，使其前爪可以牢牢抓住，拉住鼠尾在其肩膀后輕輕側(cè)推前肢側(cè)劃數(shù)英寸，重復(fù)數(shù)次，癱瘓側(cè)抵抗側(cè)推的能力下降；2分：鼠放在地面上拉其尾時(shí)向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)；1分：鼠被放在地面上自由行動(dòng)時(shí)向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)；0分：鼠被放在地面上無(wú)自發(fā)活動(dòng)。1.6 冰凍組織切片的制備，DiI熒光檢測(cè)，免疫熒光三標(biāo)，CV染色與腦梗死體積的檢測(cè)水合氯醛麻醉。4%多聚甲醛(paraformaldehyde, PA)灌注，將鼠腦取出。將鼠腦取出，固定6 h后，依次浸于20%蔗糖溶液(4% PA配)和30%蔗糖溶液(0.1 mol/L PB配)中脫水。在冰凍

21、切片機(jī)上進(jìn)行切片，腦片厚度為30 m，腦片儲(chǔ)存于原位雜交保護(hù)液中，-20 ºC保存。將DiI標(biāo)記的腦片貼于載玻片，用含50%甘油的PBS溶液封片。DiI熒光在560585 nm激發(fā)波長(zhǎng)、605635 nm發(fā)散波長(zhǎng)的熒光顯微鏡下觀察，使用CCD20倍視野下獲取腦片圖像信息(DC 300F, Leica,Germany)。將腦片從防凍保護(hù)液中挑出，常規(guī)固定、漂洗，在10%羊血清中37 ºC孵育30 min以封閉非特異性抗原的活性后，腦片分別入下列抗體組合：兔多克隆抗DOR抗體(1: 200)和小鼠抗MAP-2單克隆抗體(1: 500)中4 ºC搖床孵育72 h；PBS

22、漂洗三次，每次5 min，腦片入抗兔IgG-rodamin (1:20)和抗鼠Ig G- FITC (1: 20)中37 ºC避光孵育45 min；PBS漂洗三次，每次5 min，腦片入Hoechst 33258 (1 g/mL)中室溫避光孵育10 min；PBS漂洗兩次，每次5 min；PBS漂洗后貼片，用含50%甘油的PBS溶液封片。陰性對(duì)照腦片除了未加入一抗外，其余步驟同上，未見陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)。參照大鼠腦立體定位圖譜18選取Bregma 1.60 到-4.80 mm腦片斷面。每隔450 m取一張腦片，貼于明膠包被的載玻片上，室溫晾干后37 ºC烘干。梯度乙醇常規(guī)脫水，在

23、0.25% CV液中染色23 min，常規(guī)脫水脫脂，中性樹脂封片。經(jīng)Q570圖像分析系統(tǒng)，確定腦缺血梗死區(qū)面積，利用公式20：V=(Ai+A(i+1)/2×h算出體積，其中V代表梗死體積，Ai代表第i層斷面梗死灶面積，A(i+1)代表第i+1層斷面梗死灶面積，h代表腦片厚度。通過計(jì)算V梗死灶/V全腦體積以校正大鼠腦的個(gè)體差異及腦水腫造成的偏差。1.7 Western blot檢測(cè)取假手術(shù)組、單純腦缺血組、腦缺血 + 60 nmol TAN-67組、60 nmolTAN-67組、腦缺血 + 100 nmol naltrindole組和100nmol naltrindole組大鼠(n=4

24、/組)腦內(nèi)紋狀體組織加入0.5 mL的2% CHAPS裂解緩沖液21 (2% CHAPS,10 nmol sodium phosphate, pH 7.2, 1% sodiumdeoxycholate, 0.15 mol/L sodium chloride, proteaseinhibitor cocktail)，超聲勻漿，15 000 r/min，4 ºC離心30 min，取上清液，獲得細(xì)胞總蛋白質(zhì)，Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。制備10% SDS-聚丙烯凝膠，加樣(蛋白30 g)電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。印跡膜封閉1 h后，加入5%奶粉TBST稀釋的兔抗大鼠DOR抗體(1

25、:2 000)、室溫孵育1 h后4 ºC過夜，TBS洗膜三次，加入HRP-抗兔IgG(1:2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜三次，膜上加ECL熒光顯影劑，在暗室內(nèi)壓片(Kodak公司)；同法顯示-actin條帶。應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定陽(yáng)性條帶的光密度值，并以陽(yáng)性條帶與內(nèi)參照-actin條帶之間光密度的比值為指標(biāo)，觀察大鼠在缺血1 h再灌注24 h后，紋狀體中DOR蛋白的表達(dá)變化。1.8 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果以mean±SEM表示。多組結(jié)果比較采用單因素方差分析(one-way analysis ofvariance, ANOVA)及LSD方法進(jìn)行兩兩比較。P<0.0

26、5為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2 結(jié)果2.1 DiI標(biāo)記室管膜細(xì)胞DiI能夠標(biāo)記室管膜與室周細(xì)胞22，使用CCD20倍視野下獲取腦片圖像信息(圖 1)，從而證實(shí)實(shí)驗(yàn)所選用側(cè)腦室注射位點(diǎn)正確。2.2 皮層局部腦血流記錄正常大鼠側(cè)腦室注射naltrindole (20 nmol, 50nmol, 100 nmol) (n=3)或TAN-67 (30 nmol, 60 nmol,200 nmol) (n=3)后腦血流值顯示，與單純側(cè)腦室注射aCSF大鼠相比，藥物并不改變其皮層局部腦血478 生理學(xué)報(bào) Acta Physiologica Sinica, August 25, 2008, 60 (4): 475-

27、484流，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)；同時(shí)腦片染色顯示，神經(jīng)元形態(tài)正常，無(wú)梗死灶(數(shù)據(jù)未顯示)。而腦缺血發(fā)生后，頂葉皮層局部腦血流值驟然下降，僅為缺血前血流值的70%以下。在缺血持續(xù)的1 h內(nèi)，側(cè)腦室注射藥物與側(cè)腦室注射aCSF缺血大鼠的局部腦血流變化趨勢(shì)基本相同，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。2.3 大鼠大腦皮層、紋狀體內(nèi)DOR的表達(dá)缺血1 h再灌注24 h，選取大鼠腦片，以皮層、紋狀體作為主要觀察部位，免疫熒光結(jié)果顯示，DOR免疫陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞形態(tài)為神經(jīng)元樣，在腦內(nèi)分布廣泛，非缺血側(cè)皮層及紋狀體高表達(dá)；缺血側(cè)皮層及紋狀體表達(dá)下降(圖2)。采用熒光三標(biāo)結(jié)合激光共聚焦掃描結(jié)果顯示，DOR主要表

28、達(dá)在成熟神經(jīng)元標(biāo)記物MAP-2陽(yáng)性細(xì)胞中(圖3)。2.4 TAN-67對(duì)腦缺血的保護(hù)效應(yīng)缺血1 h再灌注24 h，單純腦缺血組梗死率為圖 1. DiI標(biāo)記室管膜層顯示側(cè)腦室Fig. 1. The DiI labels the ependymal layer lining the lateral ventricle(LV). Scale bar, 1 mm.表 1. 側(cè)腦室注射TAN-67、naltrindole對(duì)正常大鼠局部腦血流的影響(n=3)Table 1. Effects of TAN-67 and naltrindole on regional cerebral blood flow

29、(rCBF) in control rats (n=3)GroupsrCBF (%)0 min100±0100±0100±0100±0100±0100±0100±08 min84.4±6.688.4±5.684.3±3.489.4±6.983.6±3.086.8±6.790.5±6.416 min78.6±5.494.2±9.897.1±1.679.3±3.280.2±5.186.3±3.285.

30、7±3.824 min86.0±14.995.5±6.680.9±3.586.0±6.983.9±10.085.7±4.793.4±9.532 min40 min48 min91.6±5.189.5±7.086.4±4.056 min98.2±4.198.6±7.397.4±13.086.9±19.081.6±4.084.8±12.090.1±6.589.6±3.789.9±3.794.3

31、7;3.387.7±3.786.4±0.881.9±8.493.0±8.3Sham operation20 nmol naltrindole50 nmol naltrindole100 nmol naltrindole30 nmol TAN-6760 nmol TAN-67200 nmol TAN-6796.2±9.794.5±11.292.2±2.388.8±7.587.7±12.484.6±3.892.5±2.288.2±13.383.7±4.084.6

32、7;12.393.3±13.5表 2. 側(cè)腦室注射TAN-67、naltrindole對(duì)缺血大鼠局部腦血流的影響 (n=12)Table 2. Effects of TAN-67 and naltrindole on regional cerebral blood flow (rCBF) in ischemic rats (n=12)rCBF (%)Groups Before MCAO During MCAO After MCAO-10 min 0 min 8 min 16 min 24 min 32 min 40 min 48 min 56 min 64 min 72 min 80

33、 minIschemiaIschemia + 20nmol naltrindoleIschemia + 50nmol naltrindoleIschemia + 100nmol naltrindoleIschemia + 30nmol TAN-67Ischemia + 60nmol TAN-67Ischemia + 200nmol TAN-67100±019.6±4.616.9±7.618.2±5.622.9±4.822.2±5.719.0±6.419.0±4.818.9±6.370.3±8.4

34、68.2±5.569.3±4.9100±017.0±3.718.4±2.918.0±2.017.6±3.518.0±3.016.8±2.116.5±2.417.7±2.556.7±2.561.7±2.660.7±2.5100±017.1±3.817.7±2.923.3±5.222.1±5.223.0±6.019.0±4.922.1±7.522.7±4.867.2

35、77;2.764.9±5.161.2±5.6100±0 9.5±2.010.6±2.011.4±2.213.4±3.110.1±2.110.5±2.012.3±2.413.8±3.557.4±1.268.3±2.267.2±1.4100±011.4±1.815.2±1.912.7±2.511.9±1.812.5±2.311.8±2.012.1±2.315.8±3.95

36、5.2±5.870.9±1.172.9±1.1100±013.8±2.813.7±3.014.9±3.111.9±1.912.6±2.714.2±2.915.3±2.812.2±2.164.8±10.860.4±8.762.9±8.263.5±4.462.1±4.3100±016.3±5.917.2±6.019.1±7.021.8±10.523.9±13.116.4&

37、#177;5.816.1±4.323.6±10.454.9±5.6田雪松等：大鼠側(cè)腦室注射-阿片受體拮抗劑naltrindole或激動(dòng)劑TAN-67對(duì)急性腦缺血的影響479圖 2. DOR在假手術(shù)、缺血1 h再灌注24 h側(cè)大鼠皮層、紋狀體的表達(dá)Fig. 2. DOR expression in the cortex and striatum in the sham control rat and ischemic rat exposed to 1 h of MCAO and 24 h of reperfusion.The photographs showed t

38、hat DOR-positive cells (red, arrow), exhibiting neuron-like morphology, were abundant in the frontoparietalcortex and lateral caudate putamen in the sham-operated brains (A, D), but relatively rare in the rat exposed to 1 h of MCAO and 24 hof reperfusion (Core: B, E) (Penumbra: C, F). Scale bar, 20

39、m.圖 3. DOR在皮層MAP-2陽(yáng)性細(xì)胞上的表達(dá)Fig. 3. DOR expression in MAP-2 positive cells in the cortex. White arrowhead in the triple fluorescence image (D) indicated that DOR (redin A) was co-labeled in MAP-2 positive cells (green in B) and Hoechst-stained nucleus (blue in C) in non-ischemic cortex. Scale bar, 15

40、m.480 生理學(xué)報(bào) Acta Physiologica Sinica, August 25, 2008, 60 (4): 475-484 圖 4. TAN-67 和 naltrindole 對(duì) MCAO1 h 再灌注 24 h 腦梗死體積和神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響 Fig. 4. Effect of TAN-67 and naltrindole on cerebral infarct volume and neurologic deficit scores after 24 h reperfusion following 1 h MCAO. Cresyl violet-stained coro

41、nal sections were collected from the groups of sham operation (A), ischemia (B), ischemia + 60 nmol TAN67 (C) and ischemia +100 nmol naltrindole (D). The regions of pallor in white line delineate the ischemic core (lateral caudate putamen), and the penumbra (frontoparietal cortex). Note that 60 nmol

42、 TAN-67 decreased infarct volume (C), while 100 nmol naltrindole increased infarct volume (D). E: The cerebral infarct volume. F: Neurologic deficit score. *P<0.05 vs ischemia group, one-way ANOVA. 田雪松等：大鼠側(cè)腦室注射-阿片受體拮抗劑naltrindole或激動(dòng)劑TAN-67對(duì)急性腦缺血的影響481圖 5. TAN-67和naltrindole對(duì)MCAO1 h再灌24 h紋狀體DOR蛋白表

43、達(dá)的影響Fig. 5. Effects of TAN-67 and naltrindole on the expression of DOR protein in striatum at 24 h after reperfusion following 1 h MCAO.A: Three immunoblotting bands at about 60, 48 and 36 kDa were detected by rabbit polyclonal N-terminus-directed DOR antiserum(Chemicon 1560). B: Two immunoblotting

44、bands at about 60 and 48 kDa were recognized by rabbit polyclonal C-terminus-directed DORantiserum (Chemicon 5505). -actin was used as an internal standard. C, D, E: DOR protein expression detected by N-terminus-directedDOR antiserum. C: 36 kDa. D: 48 kDa. E: 60 kDa. F: Total DOR (36 kDa + 48 kDa +

45、60 kDa). *P<0.05 vs ischemia group; #P<0.05vs sham operation group; P<0.05 vsischemia + 60 nmol TAN-67 group.482 生理學(xué)報(bào) Acta Physiologica Sinica, August 25, 2008, 60 (4): 475-484(26.18±2.16)%，與腦缺血 + 30 nmol TAN-67組的梗死率(26.51±3.64)%、腦缺血 + 200 nmol TAN-67組的梗死率(25.16±3.05)%相比，無(wú)顯著性

46、差異(圖4AE)，而腦缺血 + 60 nmol TAN-67組梗死率為(18.14±2.45)%，與單純腦缺血組相比，梗死體積明顯縮小(圖4，P<0.05)。缺血1 h再灌注24 h，單純腦缺血組神經(jīng)功能缺損評(píng)分為2.76±0.28，腦缺血 + 60 nmol TAN-67組神經(jīng)功能缺損評(píng)分為3.7±0.42，與單純腦缺血組相比，評(píng)分上升，增加43.29% (P<0.05，圖4F)。2.5 Naltrindole加重腦缺血損傷缺血1 h再灌注24 h，單純腦缺血組梗死率為(26.18±2.16)%，梗死率與腦缺血 + 20 nmolnaltr

47、indole組的(24.1±2.96)%、腦缺血+50 nmolnaltrindole組的(22.50±2.63)%相比，無(wú)顯著性差異(圖4)。側(cè)腦室注射100 nmol naltrindole則明顯增加了腦缺血后的腦梗死程度。腦缺血 + 100 nmolnaltrindole組梗死率為(34.54±2.01) %，與單純腦缺血組相比，梗死體積顯著加大(P<0.05，圖4)。缺血1 h再灌注24 h，單純腦缺血組神經(jīng)功能缺損評(píng)分為2.76±0.28，腦缺血 + 100 nmol naltrindole組大鼠評(píng)分為1.6±0.25，與單純腦

48、缺血組相比，評(píng)分相對(duì)降低33.0% (P<0.05，圖4)。2.6 側(cè)腦室注射TAN-67、naltrindole對(duì)DOR蛋白表達(dá)的影響Chemicon 1560抗DOR抗體，識(shí)別的是DOR N-末端的317氨基酸序列，用該抗體行Western blot檢測(cè)，獲得大小約36 kDa、48 kDa和60 kDa的3條蛋白條帶，結(jié)果為：(1) 在約36 kDa，與假手術(shù)組相比，單純腦缺血組、腦缺血 + 60 nmol TAN-67組和腦缺血 + 100 nmol naltrindole組DOR蛋白表達(dá)明顯下降，分別為假手術(shù)組DOR蛋白含量的54.3%，68.5%和41.2% (P<0.

49、05)；60 nmol TAN-67組、100 nmol naltrindole組DOR蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異(圖5C)。腦缺血 + 60 nmol TAN-67組和單純腦缺血組組相比DOR蛋白表達(dá)下降較少，腦缺血 + 100nmol naltrindole組和單純腦缺血組相比DOR蛋白表達(dá)下降較多，但是其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 5C)。(2)在約48 kDa，各組之間DOR蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖5D)。 (3) 在約60 kDa，與假手術(shù)組相比，單純腦缺血組和腦缺血 + 100 nmol naltrindole組DOR蛋白表達(dá)下降，分別為假手術(shù)組DOR蛋白含量的58%和19%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P

50、<0.05)；腦缺血 + 60nmol TAN-67組、60 nmol TAN-67組、100 nmolnaltrindole組DOR蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異。與單純腦缺血組相比，腦缺血 + 100 nmol naltrindole組蛋白含量表達(dá)下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；腦缺血+ 60 nmol TAN-67組蛋白含量表達(dá)上升，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。腦缺血 + 60 nmol TAN-67組與腦缺血+100 nmol naltrindole組相比有顯著差異(P<0.05，圖5E)。 (4) 在總蛋白(36 kDa + 48 kDa + 60 kDa)，與假手術(shù)組相比，單純腦缺

51、血組、腦缺血 + 100 nmolnaltrindole組和腦缺血 + 60 nmol TAN-67組DOR蛋白表達(dá)下降，分別為假手術(shù)組的68%、52%和79%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；100 nmol naltrindole組、60nmol TAN-67組DOR蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異。與單純腦缺血組相比，腦缺血 + 100 nmol naltrindole組蛋白含量表達(dá)下降，腦缺血 + 60 nmol TAN-67組蛋白含量表達(dá)上升，但是兩者均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與單純腦缺血組相比，100 nmol naltrindole組、60nmol TAN-67組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)

52、。腦缺血 +60 nmol TAN-67組與腦缺血 + 100 nmol naltrindole組相比DOR蛋白表達(dá)上升53%，有顯著差異(P<0.05，圖5F)。Chemicon 5505 抗DOR抗體，識(shí)別的是DORC-末端的358372氨基酸序列，Western blot檢測(cè)獲得大小約48 kDa和60 kDa的兩條蛋白條帶(圖5B)。因此有研究者認(rèn)為36 kDa蛋白可能是DOR蛋白在C末端剪切所形成21。3 討論本實(shí)驗(yàn)明確觀察到，激活DOR對(duì)急性缺血/再灌注大鼠的腦損傷有保護(hù)作用， 而阻斷DOR則加重該損傷。以往已有工作表明，鞘內(nèi)注射DOR激動(dòng)劑SNC80可以減輕脊髓缺血后大鼠的

53、后肢運(yùn)動(dòng)障礙和神經(jīng)元損傷12；腦內(nèi)注射DOR激動(dòng)劑減輕缺血性腦損傷11。因此我們相信，DOR在缺血性腦損傷過程中確實(shí)起到腦保護(hù)作用。至于腹腔注射DOR激動(dòng)劑DADLE對(duì)于前腦缺血所致海馬損傷無(wú)保護(hù)作用17，可能由于：(1)DADLE通過血腦屏障起作用的效能較低23；(2)海馬中DOR的表達(dá)較少6，其激活不足以引發(fā)明顯的保護(hù)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，60 nmol DOR激動(dòng)劑TAN-67具有明顯的抗腦缺血損傷作用，而大劑量(200nmol)的TAN-67反而沒有腦保護(hù)效應(yīng)。其他人也曾觀察到，大劑量DOR激動(dòng)劑SNC80并不減輕脊髓田雪松等：大鼠側(cè)腦室注射-阿片受體拮抗劑naltrindole或激動(dòng)

54、劑TAN-67對(duì)急性腦缺血的影響483缺血后大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)障礙12，DADLE在小劑量具有抗凋亡效應(yīng)，大劑量反而引起細(xì)胞損傷24。其原因可簡(jiǎn)單歸之于藥物的毒性反應(yīng)。任何一種藥物，即使是神經(jīng)保護(hù)劑，當(dāng)其超過適當(dāng)范圍，就有可能招致毒性反應(yīng)。我們所使用的DOR抗體檢測(cè)到三條大小不同的信號(hào)帶。文獻(xiàn)報(bào)道中有關(guān)DOR蛋白的條帶表現(xiàn)形式多有不同。有文獻(xiàn)指出，識(shí)別大鼠DOR N-末端的317氨基酸序列(LVPSARAELQSSPLV)的抗DOR可以辨認(rèn)出36、48 和72 kDa 3個(gè)條帶。其中48 kDa的胞漿蛋白代表DOR蛋白全長(zhǎng)表達(dá)，36 kDa可能由48 kDa DOR蛋白的C末端在翻譯后后修飾剪切所

55、形成，72 kDa為36 kDa形成的二聚體21。也有文獻(xiàn)報(bào)道，識(shí)別DOR N-末端的317氨基酸序列(LVPSARAELQSSPLV)的抗DOR抗體可以辨認(rèn)出38、49 和62 kDa 的條帶，38 kDa為非糖基化蛋白，49和62 kDa為糖基化蛋白，其中49 kDa為胞漿蛋白而62 kDa代表膜蛋白25。大量文獻(xiàn)顯示60 kDa DOR蛋白位于細(xì)胞膜外，與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)26-28。也有報(bào)道提出36 kDa蛋白同樣也存在于胞膜和核膜上，在阿片誘導(dǎo)的受體下調(diào)后，36 kDa蛋白最先出現(xiàn)在核膜上并且高表達(dá)29，36 kDa DOR蛋白同樣也參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)30-32。本實(shí)驗(yàn)中，我們使用chem

56、icom 1560抗體清晰地檢測(cè)到3個(gè)條帶，分別位于36、48 和60 kDa。結(jié)合文獻(xiàn)中Western blot 的報(bào)道，我們認(rèn)為36和38 kDa，48和49 kDa，60 kDa和62 kDa可能分別代表同一條帶，其微小差異可能是各實(shí)驗(yàn)室的不同實(shí)驗(yàn)條件所致。激光共聚焦顯示的熒光免疫圖像表明，DOR主要表達(dá)在成熟神經(jīng)元標(biāo)記物MAP-2陽(yáng)性的細(xì)胞上(圖3)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，60 nmol TAN-67在腦保護(hù)的同時(shí)并未顯著改變DOR蛋白的表達(dá)，表明DOR激動(dòng)劑主要通過增強(qiáng)神經(jīng)元上DOR活性而非提高DOR表達(dá)而起到腦保護(hù)的作用。 DOR拮抗劑在加劇腦損傷的同時(shí)進(jìn)一步降低約60 kDa的DOR蛋

57、白的表達(dá)，可能與神經(jīng)元內(nèi)DOR表達(dá)功能的受損有關(guān)。DOR的神經(jīng)保護(hù)機(jī)理可能與增強(qiáng)離子平衡1-3和調(diào)節(jié)PKC-MAPK-Bcl2的系列通路有關(guān)5,14。此外，DOR可以促進(jìn)BDNF的表達(dá)33，而BDNF是機(jī)體神經(jīng)元對(duì)缺血、缺氧自我保護(hù)的一個(gè)重要機(jī)制34，因此DOR對(duì)缺血缺氧神經(jīng)元的保護(hù)作用也可能與BDNF的活動(dòng)有關(guān)。但DOR保護(hù)急性缺血細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尚待進(jìn)一步闡明。參考文獻(xiàn)1Chao D, Bazzy-Asaad A, Balboni G, Salvadori S, Xia Y.Activation of DOR attenuates anoxic K+ derangement viainh

58、ibition of Na+ entry in mouse cortex. Cereb Cortex 2008 Jan17. DOI: 10.1093/cercor/bhm247.2Hong SS, Qian H, Zhao P, Bazzy-Asaad A, Xia Y. Anisomycinprotects cortical neurons from prolonged hypoxia with dif-ferential regulation of p38 and ERK. Brain Res 2007; 1149:76-86.3Chao D, Donnelly DF, Feng Y,

59、Bazzy-Asaad A, Xia Y. Cor-tical delta-opioid receptors potentiate K homeostasis duringanoxia and oxygen-glucose deprivation. J Cereb Blood FlowMetab 2007; 27(2): 356-368.4Zhang J, Qian H, Zhao P, Hong SS, Xia Y. Rapid hypoxiapreconditioning protects cortical neurons from glutamate toxicitythrough delta-opioid receptor. Stroke 2006; 37(4): 1094-1099.5Ma MC, Qian H, Ghassemi F, Zhao P, Xia Y. Oxygen-sensi-tive delta-opioid receptor-regulated survival and death signals: