當歸注射液對缺血再灌注損傷心肌細胞乳酸脫氫酶活性的影響(1)

1、    當歸注射液對缺血再灌注損傷心肌細胞乳酸脫氫酶活性的影響(1)    】 目的：觀察當歸對缺血再灌注損傷心肌組織中乳酸脫氫酶(LDH)活性，探討當歸抗心肌缺血再灌注損傷保護作用的機理。方法:將30只SD大鼠隨機分成3組(每組n=10) :假手術組(組)、缺血再灌注組(組)和當歸治療組(組) ,建立在體心肌缺血再灌注動物模型。實驗完畢后，將各組動物心肌組織做組織化學染色，觀察各組動物心肌細胞內乳酸脫氫酶(LDH)活性的變化。利用HPIAS2000圖像分析系統(tǒng)測定LDH在以上3組中表達的平均光密度和平均陽性面積率

2、。結果：當歸治療組心肌細胞中乳酸脫氫酶(LDH)活性反應物呈顆粒狀,均勻分布于肌膜下或肌絲區(qū)之間, 顆粒呈深紫色, 表示酶活性很強；假手術組酶反應物呈淺紫色細小顆粒狀，肌膜下或肌絲區(qū)之間可見少量的紫色顆粒，分布較稀疏，表示酶活性較弱；缺血再灌注損傷組乳酸脫氫酶(LDH)反應物極弱，幾乎未見酶活性表達。圖像分析結果顯示當歸治療組與假手術組和缺血再灌注損傷組之間乳酸脫氫酶(LDH)活性的平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01)；假手術組與缺血再灌注損傷組之間乳酸脫氫酶(LDH)活性的平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P>0.05)。結論：當歸注射液對大鼠缺血再灌

3、注損傷心肌細胞有重的保護作用。 【關鍵詞】 當歸注射液； 缺血再灌注； 心肌； 乳酸脫氫酶(LDH)目前雖然對缺血或缺血再灌注損傷的確切機制還不十分清楚,但已經知道損傷的臨床結局主就是細胞死亡。細胞死亡有兩種形式:一種是壞死,另一種是凋亡。凋亡(apoptosis) 是細胞在基因調控下的主動性死亡,不引起炎癥反應。持續(xù)缺血和缺血再灌注時心肌組織都可發(fā)生細胞凋亡。已經證實,人類心肌梗死除細胞壞死外,細胞凋亡也參與了梗死的病理過程,細胞凋亡不僅影響梗死面積,而且促成心臟結構的重構,心肌梗死的早期和晚期均存在凋亡現(xiàn)象。當歸為傘形科植物當歸Angelicasinennsis(Oliv.)Diels的干

4、燥根，味甘、辛,性溫，能補血和血,調經止痛,潤燥滑腸。有文獻報道1，當歸對冠心病患者有平衡和抑制血小板聚集的作用，因而能明顯改善胸痛、胸悶等臨床癥狀和心電圖缺血性STT 的變化, 是治療冠心病的有效藥物2。但當歸對缺血再灌注損傷心肌細胞結構的影響，目前國內外未見報道。本研究采用組織化學方法，探討當歸抗心肌缺血再灌注損傷保護作用的機理。1 材料與方法11 動物模型制備及分組健康雄性SD大鼠（SPF級）30只,體重250300g 左右，由武漢大學醫(yī)學院動物試驗中心提供。腹腔注射戊巴比妥鈉4.5 mg·(100 g)-1 ,麻醉動物后行氣管切開接微型呼吸機人工呼吸（呼吸頻率60次·

5、;min-1 ,潮氣量2ml·(100g)-1,微型呼吸機由第二軍醫(yī)大學生產）,沿胸骨左緣第4 肋骨開胸在左心室、右心室與左心房交界處結扎/ 開放左冠狀動脈前降支建立心肌缺血再灌注模型。將動物隨機分成3組(每組n=15):假手術組(組) ,絲線穿過冠狀動脈前降支但不結扎；缺血再灌注組( 組) ,缺血再灌注前5min 腹腔注射生理鹽水0.8 ml·(100 g)；當歸治療組( 組),缺血再灌注前5min 腹腔注射當歸注射液0.8 ml·(100g)-1 。每組5只動物缺血30min再灌注40min ,10只動物缺血30min 再灌注120min。在缺血再灌注開始前,

6、 經舌靜脈注射伊文氏藍, 缺血40min后心尖無藍色且呈烏紅部分為缺血區(qū),再灌注120min 后心肌經TTC處理后心尖為白色部分為梗死區(qū)。12 主試劑25%當歸注射液(武漢大學中南醫(yī)院制藥廠,批號為970118)。13 標本制作及觀察 取新鮮組織冰凍切片； 切片入下液作用530min 0.5 M乳酸鈉    6ml 1.5%乳酸脫氫酶水溶液 2ml 0.2M磷酸緩沖液pH7.4 10ml 蒸餾水 6ml 生理鹽水稍洗； 10%甲醛鹽水固定10min； 15%酒精稍洗1min； 生理鹽水稍洗； 甘油明膠封片。14 圖像分析采用HPLAS2000高清晰度彩色

7、病理圖文報告管理系統(tǒng)對酶活性表達進行定量分析,每張切片隨機選取5個高倍鏡視野(×400),測定乳酸脫氫酶(LDH)每個視野下陽性反應的平均光密度、陽性反應面積和所有細胞總面積,計算陽性面積率。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。15 統(tǒng)計學處理用SPSS11.5軟件對各組乳酸脫氫酶(LDH)反應陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和()檢驗,檢驗水準為0.05。    2 結果21 光鏡觀察假手術組可見心肌細胞呈短圓柱狀，有分支，但可見部分胞漿溶解；缺血再灌注損傷組見心肌細胞呈短圓柱狀，有分支，胞漿溶解呈

8、空泡或網(wǎng)狀，細胞界限模糊，可見心肌細胞斷裂；當歸治療組可見心肌細胞呈短圓柱狀，有分支，細胞核呈橢圓形位于中央，胞漿內可見平行排列的肌原纖維，細胞輪廓清晰。22 組織化學觀察乳酸脫氫酶(LDH)活性 當歸治療組心肌細胞中乳酸脫氫酶(LDH)反應物呈顆粒狀,均勻分布于肌膜下或胞漿內, 顆粒呈深紫色, 表示酶活性很強；假手術組肌酶反應物呈淺紫色細小顆粒狀，可見少量的紫色顆粒，分布較稀疏，表示酶活性較弱；缺血再灌注損傷組乳酸脫氫酶(LDH)反應物極弱，幾乎未見酶活性表達，表示無酶活性表達。經單因素方差分析,各組間的差異有顯著性意義(P<0.05)，見表1。經SNK(q)檢驗, 當歸治療組與假手術

9、組和缺血再灌注損傷組之間乳酸脫氫酶(LDH)活性的平均光密度及陽性面積率分別為：當歸治療組平均光密度0.3251±0.0528；假手術組平均光密度0.0986±0.0083；缺血再灌注損傷組平均光密度0.0872±0.0075。當歸治療組陽性面積率0.3913±0.0630； 假手術組陽性面積率0.0968±0.0074；缺血再灌注損傷組陽性面積率0.0871±0.0069。當歸治療組與假手術組比較平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01)；當歸治療組與缺血再灌注損傷組比較平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(

10、P<0.01)；假手術組與缺血再灌注損傷組之間比較平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P>0 05)。表1 當歸注射液對大鼠缺血/再灌注損傷心肌細胞內乳酸脫氫酶(LDH)活性影響的平均光密度和陽性面積率（略）注: * 當歸治療組與假手術組比較,P<0.001;當歸治療組與缺血再灌注損傷組比較,P<0.05; * 假手術組與缺血再灌注損傷組比較,P>0.05。3 討論自1977年Hearse首次提出缺血再灌注損傷概念以來，已逐漸引起醫(yī)學界的高度重視。大量動物實驗顯示，氧自由基、鈣超載、心肌纖維能量代謝障礙、血管內皮細胞、一氧化氮、中性粒細胞、細胞黏附分子和細胞

11、凋亡等均可能參與再灌注損傷的發(fā)病過程。目前雖然對缺血或缺血再灌注損傷的確切機制還不十分清楚,但已經知道損傷的臨床結局主就是細胞死亡。已經證實,人類心肌梗死除細胞壞死外,細胞凋亡也參與了梗死的病理過程,細胞凋亡不僅影響梗死面積,而且促成心臟結構的重構,心肌梗死的早期和晚期均存在凋亡現(xiàn)象3。缺血再灌注損傷對心肌組織的結構和功能的影響一直是研究的重點之一。當歸的藥用價值早已為人們所認識, 從當歸的乙醇提取物中分離到6種化合物分別為: (E)藁本內酯、(Z)藁本內酯、 (Z)正丁基呋內酯、棕櫚酸、 B2谷甾醇、 阿魏酸。此外還含有蔗糖、多種氨基酸及微量金屬元素、煙酸、 丁二酸、 腺嘌呤、 尿嘧啶、 膽

12、堿等成分。當歸的藥理作用主是：促進機體免疫；對呼吸系統(tǒng)的作用；對血液循環(huán)系統(tǒng)的作用。有文獻報道4，5， 當歸對冠心病患者有平衡和抑制血小板聚集的作用，因而能明顯改善胸痛、胸悶等臨床癥狀和心電圖缺血性STT 的變化, 是治療冠心病的有效藥物6。當歸具有鈣通道阻滯作用, 拮抗鈣超載, 對心肌缺血再灌注所致心肌損傷有保護作用。在缺血及再灌注狀態(tài)下, 心臟順應性及射血功能得到良好的保護, 使反映心肌損傷程度的CPK 活性和氧自由基損傷過程產生的過氧化脂質分解產物MDA 的濃度大大降低7。本實驗通過結扎/松解左冠狀動脈前降支復制心肌缺血再灌注模型，并用當歸注射液預處理，通過組織化學方法顯示乳酸脫氫酶(L

13、DH)活性，結果顯示當歸治療組心肌細胞中乳酸脫氫酶(LDH)活性很強，假手術組心肌細胞中乳酸脫氫酶(LDH)活性較弱，缺血再灌注損傷組乳酸脫氫酶(LDH)酶活性極低。經統(tǒng)計學分析處理，當歸治療組與假手術組比較平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01)；當歸治療組與缺血再灌注損傷組比較平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01)；假手術組與缺血再灌注損傷組之間比較平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P>0 05)。有文獻報道心肌缺血30min在超微酶細胞化學水平便可顯示SDH和LDH活性的降低，以后隨缺血時間的延長，改變更加明顯，直至酶染顆粒完全

14、消失。我們的實驗也已證明了這一點。通過實驗表明：當歸注射液預處理提高了心肌酶的活性并維持了細胞超微結構的完整性，對缺血再灌注心肌細胞有保護作用。其保護作用可能機制是：改善心肌收縮功能，增加能量儲備：當歸注射液具有心肌抑制效應，可以降低心肌耗氧量，增加氧供需比，有利于心肌儲存較多的能量。缺血后，心肌首先動用儲備的ATP和氧，由于當歸注射液提高了心肌的能量儲備，ATP下降緩慢，無氧酵解推遲發(fā)生，而且能夠對抗氧自由基對心肌的損傷，保護了線粒體的功能；更重的是能夠保存缺血期ATP分解的底物，從而為再灌后心肌合成ATP提供原料，促進能量代謝的恢復。增加冠脈流量：主擴張小冠狀動脈，增加心肌冠脈血流、增加心

15、肌氧供。減少灌注期間自由基的釋放：當歸注射液可以促進缺血后心肌超氧化物岐化酶（superoxide dismutase,SOD）活性的恢復，抑制丙二醛生成，減少氧自由基的生成，減輕對心肌的損害。減少鈣離子內流：當歸注射液可減少缺血后細胞內鈣離子濃度。它抑制鈉/鈣交換，并于L型鈣通道結合，減少鈣內流，儲存在肌漿網(wǎng)中的鈣離子通過開放理阿諾堿受體鈣釋放通道復合體，鈣離子流向細胞外，而使細胞內鈣減少，促進心肌的功能性恢復，減少心肌梗死面積。從以上的實驗結果和討論來分析當歸注射液為防治缺血再灌注損傷的應用具有重的研究意義，并且為加強心肌保護作用提供了重的理論依據(jù)。   &#

16、160;        【摘】目的：觀察當歸對缺血再灌注損傷心肌組織中乳酸脫氫酶(LDH)活性，探討當歸抗心肌缺血再灌注損傷保護作         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯(lián)系我們?！緟⒖嘉墨I】1 Komai H , Rusy BFEffects of inhibition of tra

17、nssar colemmal calciam inlux by nickel on force of postrest contraction on contracture inducde by rapid colling. Cardiovase Res , 1993, 27:8012 Kark M , Ziemer G, Zoeller M，et al . Protection of the chronic hypoxic immature rat heart during globalischemia. Ann Thorac Surg ,1995 , 59 : 6993 徐新春.鈣超載與心肌缺血再灌注損傷. 心血管病學進展,2000 ,21 (4) : 2274 Das DK, Neogi A. Effects of superoxide anions the Na K ATP system in r