抗登革病毒3型單鏈抗體的基因克隆表達(dá)和免疫學(xué)鑒定

1、    抗登革病毒3型單鏈抗體的基因克隆 表達(dá)和免疫學(xué)鑒定        【摘要】目的研究單鏈抗體在治療中的免疫反應(yīng)問題。方法選用對登革病毒四個血清型及部分黃病毒具有中和活性的抗登革3型病毒單克隆抗體3D3的輕重鏈可變區(qū)基因，通過反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增，擴(kuò)增后的輕重鏈可變區(qū)PCR產(chǎn)物通過一個93個核苷酸連接引物連接成單鏈抗體基因(ScFv)，然后將其基因克隆到噬菌體表達(dá)載體pCANTAB5的外殼蛋白g3p基因中，使單鏈抗體以融合蛋白的形式表達(dá)于噬菌

2、體的表面。結(jié)果通過免疫熒光鑒定，這種抗體仍保留著親代抗體的特性，能與登革3型病毒發(fā)生特異性結(jié)合。結(jié)論這一研究結(jié)果為登革3型病毒抗體在登革病毒的診斷和治療的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)?！局黝}詞】登革病毒抗體，單鏈聚合酶鏈反應(yīng)克隆表達(dá)Gene cloning, expression and immunological identification of a single chain antibody fragment 3D3 against Dengue type 3 virusSi Bingyin, Yang Peiying, Qin Ede, et al.Institute of Microbiology

3、 and Epidemiology, Academy of Military Medical Scienes, Beijing 100850AbstractHybridoma 3D3 which secreted monoclonal antibody against Dengue type 3 virus was used to extract mRNA and then was reverse-transcripted into cDNA for amplifying heavy and light chain variable domain genes. The amplified li

4、hgt and heavy chain variable domain genes were connected by flexible linker to form a single chain antilody fragment (ScFv) gene of 750bp, which was cloned into phage pCANTAB5 vector using the recombinant phage antibody system. The ScFv gene was expressed as fusion protein with phage g3p coat protei

5、n and displayed on the phage surface. The phagemid was used to transform competent E.coli TG1 cells and then infected with M13K07 helper phage to rescue the phagemid and antibody ScFv gene.12 of the 20 randomized clones were shown to react with dengue type 3 virus by immunofluorescence.Key words:Den

6、gue virusAntibody fragment,single chainCloningExpressionPolymerase chain reaction自從1975年雜交瘤技術(shù)問世以來，單克隆抗體作為診斷試劑，在疾病的診斷中已得到了廣泛的應(yīng)用。但是在疾病的治療方面，由于人源化抗體制備技術(shù)目前尚不完善，臨床上使用的單克隆抗體大都是鼠源性的，后者容易引起抗鼠抗體，對鼠單抗產(chǎn)生排斥反應(yīng)，因此限制了它的臨床應(yīng)用。為了克服鼠源性單抗這一缺陷及人源性單抗制備上的因難，人們試通過生物工程的方法來解決這一難題，相繼產(chǎn)生了人/鼠嵌合抗體1、人源化抗體2和單鏈抗體3，4以解決單克隆抗體在治療中存在的免疫

7、反應(yīng)問題。單鏈抗體(Single chain antibody fragment,ScFv)是目前人們研究最活躍的領(lǐng)域之一，它是由連接肽把重鏈可變區(qū)(HV)和輕鏈可變區(qū)(LV)連接而產(chǎn)生的，這種抗體由于僅含有抗體分子的重鏈和輕鏈可變區(qū)和一段由十幾個氨基酸組成的多肽，其分子量小，不含有抗體的Fc片段，不被細(xì)胞結(jié)合，在體內(nèi)不易產(chǎn)生排斥反應(yīng)，因此作為一種治療制劑在臨床上比完整抗體具有更多的優(yōu)越性。為此我們選用抗登革3型病毒與登革1、2、4型病毒在免疫熒光和血凝抑制有交叉反應(yīng)的單克隆抗體3D3的單鏈抗體進(jìn)行了研究。1材料和方法1.1雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定抗登革3型病毒的單克隆抗體3D3經(jīng)中和試驗(yàn)證明具

8、有中和登革3、1、2、4型病毒和部分黃病毒的活性5，經(jīng)IgG亞類鑒定是IgG1，雜交細(xì)胞在含有10%牛血清的1640 RPMI培養(yǎng)基上培養(yǎng)。1.2雜交瘤細(xì)胞mRMA的提取用Promega公司的總RNA提取試劑盒提取總RNA。然后用Promega公司mRNA提取試劑盒從總RNA中提取mRNA,方法見說明書。1.3cDNA的合成及輕、重鏈可變區(qū)基因PCR擴(kuò)增按照Pharmacia公司的重組噬菌體系統(tǒng)試劑盒說明書操作，以純化的mRNA為模板，以隨機(jī)六寡聚核苷酸為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成第一鏈cDNA,以cDNA為模板，在50l的反應(yīng)體系中分別加入輕、重鏈可變區(qū)引物，2.5U的TaqDNA聚合酶(

9、Promega公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。條件是：941分鐘，55退火2分鐘，72延伸2分鐘，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后一個循環(huán)后72再延伸10分鐘。分別從輕、重鏈可變區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中取3l在 1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其余部分用MicrospinTM柱分別對輕、重鏈進(jìn)行純化。重鏈Marker和ScFv Marker均來自pharmacia試劑盒。1.4ScFv基因的組裝及PCR擴(kuò)增純化的HV和LV基因片段與連接引物在等摩爾濃度的條件下，在25l的反應(yīng)體積中，加入2.5mmol/L dNTP和2.5U的TaqDNA聚合酶，進(jìn)行7次退火反應(yīng)組裝成ScFv，每次退火反應(yīng)的條件是94變性1分鐘，55退火4

10、分鐘。然后以ScFv基因片斷為模板，在上述反應(yīng)體系中加入一對在ScFv的5含有Sfi，在3含有Not的雙酶切位點(diǎn)的引物，進(jìn)行PCR循環(huán)：94變性1分鐘，55退火2分鐘，72延伸2分鐘，最后一次循環(huán)在72保溫10分鐘。1.5ScFv基因片段的克隆與表達(dá)擴(kuò)增好的ScFv片段經(jīng)Sephacryl-400柱純化后，用Sfi和Not雙酶切，然后將雙酶切好的ScFv片段與載體pCANTAB5質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素選擇性培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化菌落，用2×YT-AG培養(yǎng)基(2×YT含有100l/ml氨芐青霉素和2%葡萄糖)從選擇培養(yǎng)基收集全部轉(zhuǎn)化的菌落并將其細(xì)胞懸液稀

11、釋至A600處的吸收值約0.30.4左右，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取3.2ml細(xì)胞懸液加入11.6×109PFU M13 K07噬菌體于37培養(yǎng)1小時，將細(xì)胞離心重懸于20ml不含葡萄糖、含有100l/ml氨芐青霉素50l/ml的卡哪霉素的2×YT培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)過夜，離心收集含有重組噬菌體的上清。1.6登革病毒抗原的制備在一個細(xì)胞瓶內(nèi)待C6/36細(xì)胞單層后感染登革3型病毒，等細(xì)胞病變+后去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗1次，等細(xì)胞干后用冷丙酮在-20固定1小時，去除丙酮后放-20備用。1.7登革病毒抗原片的制備C6/36細(xì)胞成單層后感染登革3型病毒，待細(xì)胞病變一個+后，用適量的細(xì)胞

12、培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，將其滴到鍍膜的玻片上，放37 CO2孵箱培養(yǎng)812小時，然后用PBS洗玻片去除未貼壁的細(xì)胞，等細(xì)胞干后用冰冷的丙酮在-20固定30分鐘，取出后放-20備用。1.8免疫親合法篩選重組噬菌體含有重組噬菌體的上清液5ml與丙酮固定的登革病毒抗原在37保溫1.5小時，用PBS(含有0.5%Tween-20)在振蕩器上洗6次，每次振蕩5分鐘，去除未與登革3型病毒抗原特異性結(jié)合的重組噬菌體。加5ml的對數(shù)生長期的TG1細(xì)胞，在37保溫1小時，然后將感染細(xì)胞涂在含有100g/ml氨芐青霉素固體培養(yǎng)上，30培養(yǎng)過夜，從固體培養(yǎng)基上隨機(jī)挑選20個單個菌落，分別在200l 2×YT-AG

13、培養(yǎng)基上30培養(yǎng)過夜，次日用M13K07噬菌體分別感染轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，將感染的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有氨芐青霉素和卡哪霉素的2×YT培養(yǎng)基中37培養(yǎng)過夜，次日離心，上清液含有抗體表達(dá)的噬菌體作免疫熒光。1.9免疫熒光鑒定陽性克隆在登革3型病毒感染的C6/36細(xì)胞抗原片上加10l表達(dá)的噬菌體樣品，37保溫40分鐘，洗滌去除未與登革病毒抗原結(jié)合的噬菌體，加10l兔抗M13噬菌體抗體，37保溫40分鐘，洗滌，然后加10l 1：16稀釋的羊抗兔熒光素標(biāo)記的IgG，37保溫40分鐘，洗滌，觀測結(jié)果。2結(jié)果2.13D3單抗HV和LV基因片段的擴(kuò)增及鑒定結(jié)果見1。2.2抗體可變區(qū)的基因拼接和PCR擴(kuò)增回收的HV

14、和LV片段與連接引物(93個核苷酸)在等摩爾濃度下經(jīng)7次退火循環(huán)組裝成單鏈可變區(qū)基因片段(ScFv)，以ScFv為模板加入一對在5含有Sfi、在3含Not酶切位點(diǎn)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增35個循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，結(jié)果見2，可見ScFv片段的大小與ScFv Marker相一致約750bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)Sfi和Not雙酶切純化后，得到帶有酶切位點(diǎn)的ScFv片段。<"16 (18911 bytes)" src="/med/cano/201003/20100319180304802" 140 205>1LV和HV基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒

15、定Fig.1Identification of the PCR products of the HV and LV1: LV PCR product; 2:Standard HV marker; 3: HV PCR product<"17 (18764 bytes)" src="/med/cano/201003/20100319180304223" 125 207>2ScFv基因組裝，擴(kuò)增產(chǎn)物PCR鑒定結(jié)果Fig.2Identification of assembly and amplification of ScFv gene by PCR

16、1: 750bp ScFv PCR product;2: ScFv marker of 750bp DNA2.3ScFv基因的克隆與表達(dá)將純化的帶有酶切位點(diǎn)的ScFv基因克隆到噬菌體載體pCANTAB5上，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1，用選擇性固體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化菌，從選擇培養(yǎng)基上收集全部轉(zhuǎn)化的菌落，用M13K07噬菌體感染轉(zhuǎn)化菌，在含葡萄糖、氨芐和卡那霉素的2-YT培養(yǎng)基進(jìn)行篩選重組噬菌體。由于M13K07噬菌體的攜帶抗卡那霉素基因并能拯救噬菌體蛋白的表達(dá)和組裝，因此只有感染M13K07噬菌體的細(xì)菌才能在卡那霉素培養(yǎng)基上生長并使單鏈抗體表達(dá)在噬菌體表面。2.4具有免疫活性重組噬菌體的篩選把重組

17、噬菌體與登革3型病毒抗原在37保溫后，用含有0.5% Tween-20的PBS在振蕩器充分洗滌以去除未與登革3型病毒抗原結(jié)合的噬菌體(表達(dá)陰性的噬菌體)，這樣通過表達(dá)在噬菌體表面的單鏈抗體能與登革3型病毒抗原特異性結(jié)合的特性篩選出陽性克隆，然后用能與登革3型病毒抗原結(jié)合的噬菌體感染TG1細(xì)胞，接種到氨芐選擇性培養(yǎng)基上隨機(jī)挑選20個克隆，其中1號克隆經(jīng)培養(yǎng)后用堿法提取pCANTAB5-ScFv重組質(zhì)粒，用Hind 和BamH 雙酶切，其酶解產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。如果ScFv基因沒有插到pCANTAB5E載體上可產(chǎn)生3條帶，分別為3170bp，607bp和102bp的片段，如果ScFv基

18、因插到pCANTAB5E載體上可產(chǎn)生3條分別約為3170bp，607bp和850bp的片段。從3上可以看出3條帶分別約為3200pb，850pb和600pb。其中850pb的片段含有ScFv基因，說明ScFv基因插到載體上了。2.5表達(dá)產(chǎn)物的鑒定重組噬菌體上清液用丙酮固定的登革病毒感染的C6/36抗原片，兔抗M13噬菌體抗體和熒光素標(biāo)記羊抗兔IgG進(jìn)行免疫熒光鑒定，結(jié)果表明，20個克隆有12個克隆能與登革3型病毒抗原發(fā)生特異性的結(jié)合，其中6、9、20號克隆免疫熒光最強(qiáng)(4)，從中(9號克隆)的結(jié)果可以看出，重組噬菌體抗體與登革3型病毒抗原的結(jié)合發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，與登革病毒在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制和與原單克

19、隆抗體3D3與登革3型病毒抗原結(jié)合發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)是一致的，說明重組噬菌體抗體與登革3型病毒抗原結(jié)合是特異性的。<"18 (19598 bytes)" src="/med/cano/201003/20100319180304308" 162 245>3重組質(zhì)粒1號用Hind 和BamH 雙酶切Fig.3Identification of recombinant plasmid digested with Hind and BamH 1: Recombinant plasmid digested with Hind and BamH . 2:Re

20、combinant plasmid digested with Hind . 3:DNA/Hind marker<"19 (55632 bytes)" src="/med/cano/201003/20100319180305169" 285 181>4用登革3型病毒感染的C6/36細(xì)胞抗原檢測噬菌體表達(dá)的ScFv間接免疫熒光結(jié)果(9號質(zhì)粒)Fig.4Indirect immunofluorescence of phage expressed ScFv on Dengue type 3 virus infected C6/36 cells3討論

21、我們利用Pharmacia公司最近推出的重組噬菌體抗體系統(tǒng)試劑盒，對抗登革3型病毒單克隆抗體3D3的單鏈抗體進(jìn)行構(gòu)建，克隆及表達(dá)，通過免疫熒光對表達(dá)產(chǎn)物的分析，結(jié)果表明噬菌體-單鏈抗體保留了親代抗體的特性，能與登革3型病毒抗原發(fā)生特異性的結(jié)合，這一研究結(jié)果為抗登革3型病毒抗體在登革病毒的診斷和治療的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。目前常用來獲得抗體可變區(qū)基因的方法大多從mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再進(jìn)行PCR6或由基因組中直接PCR7獲得。我們采用Pharacia公司的試劑盒，從mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后加入兩組混合引物分別對輕、重鏈可變區(qū)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由于是混合引物對某些雜交瘤細(xì)胞可能產(chǎn)生一條異

22、常的輕鏈和重鏈，按照試劑盒試劑說明書屬于正?，F(xiàn)象，我們在輕、重鏈可變區(qū)基因的擴(kuò)增中在輕鏈出現(xiàn)了一條異常的帶，由于它的分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于輕鏈，所以我們在輕鏈的回收中僅回收了輕鏈帶，如果兩條帶分子量相近可以把兩條帶都回收，使其與重鏈連接引物一起連接，可以在噬菌體抗體篩選過程中由于抗體表達(dá)異常的噬菌體不能與抗原發(fā)生特異性的結(jié)合而被篩掉。參考文獻(xiàn)1Sharon J, Gefer M L, Morrison S L, et al. Expression of a chimaeric protein in mouse myeloma cells. Nature, 1984, 309:364-367.2Boulianne, Hozumi N, Shulwan M J, et al. Production of functional chimaeric mouse/human antibody. Nature, 1984, 312:64