第八章蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定

1、凱氏定氮法凱氏定氮法杜馬斯法杜馬斯法福林酚法福林酚法染色法染色法 蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量 換算系數(shù)換算系數(shù) 蛋或肉蛋或肉 16.0 6.25 牛牛 奶奶 15.7 6.38 小小 麥麥 18.76 5.33 玉玉 米米 17.70 5.56 燕燕 麥麥 18.66 5.36 大大 豆豆 18.12 5.52 大大 米米 19.34 5.17 6.25=6.25=6.38=5.952NH2(CH2) 2COOH+13H2SO4 (NH4) 2SO4+6CO2+12SO2+16H2O加硫酸鉀加硫酸鉀 作為增溫劑，提高溶液沸點(diǎn)作為增溫劑，提高溶液沸點(diǎn)加硫酸銅加硫酸銅 作為催化劑、消化終點(diǎn)指示劑作為催化

2、劑、消化終點(diǎn)指示劑加氧化劑加氧化劑 加速有機(jī)物氧化速度加速有機(jī)物氧化速度NH4+ + OH-= NH3 +H2O用用4%硼酸吸收，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定硼酸吸收，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定 指示劑：混合指示劑（甲基紅指示劑：混合指示劑（甲基紅溴甲基酚綠）溴甲基酚綠） 指示劑指示劑 紅色紅色 綠色綠色 紅色紅色 （酸）（酸） （堿）（堿） （酸）（酸） 吸收與滴定吸收與滴定反應(yīng)式為：反應(yīng)式為： NHNH3 3+H+H3 3BOBO3 3=NH=NH4 4+ +H+H2 2BOBO3 3- - H H2 2BOBO3 3- -+H+H+ +=H=H3 3BOBO3 3 用過量的用過量的 H2SO4 或或 HC

3、l 標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收，再標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收，再用用 NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定過剩的酸液。標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定過剩的酸液。量量NaOHNaOH少少1000W%100K)(CMVVN21NH2CONHCONH2 + NH3NH2CONH2 + NH2CONH2150160雙縮脲雙縮脲能和硫酸銅的堿性能和硫酸銅的堿性溶液生成溶液生成紫色絡(luò)和物紫色絡(luò)和物。紫色絡(luò)和物。紫色絡(luò)和物。操作方法操作方法 1 1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線取取1010支干試管分成兩組，按下表平行操作支干試管分成兩組，按下表平行操作0 01 12 23 34 45 5標(biāo)準(zhǔn)蛋白液標(biāo)準(zhǔn)蛋白液/ml/ml 0.20.20.40.40.60.60.80.8

4、1.01.0蛋白濃度蛋白濃度/(mg/ml)/(mg/ml) 2.02.04.04.06.06.08.08.010.010.0蒸餾水蒸餾水/ml/ml1.01.00.80.80.60.60.40.40.20.20.00.0雙縮脲試劑雙縮脲試劑/ml/ml4.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.0 A A540 取兩組測(cè)定的取兩組測(cè)定的A A540值的平均值，即值的平均值，即A A540540為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2 2、樣品測(cè)定、樣品測(cè)定取取4 4支試管分成兩組，按下表平行操作：支試管分成兩組，按下

5、表平行操作： 0 01 1樣品稀釋液樣品稀釋液/ml/ml 0.50.5蒸餾水蒸餾水/ml/ml1.01.00.50.5雙縮脲試劑雙縮脲試劑/ml/ml4.04.04.04.0A A540 %100(%)cNY固體樣品蛋白質(zhì)的含量(1)(1)在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅離子作用生成蛋白質(zhì)在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅離子作用生成蛋白質(zhì)銅銅絡(luò)合物。絡(luò)合物。(2)(2)此絡(luò)合物將試劑磷鉬酸此絡(luò)合物將試劑磷鉬酸磷鎢酸磷鎢酸( (olinolin試劑試劑) )還原，還原，混合物深藍(lán)色混合物深藍(lán)色( (磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物) ) 。凱式定氮法凱式定氮法雙縮脲雙縮脲杜馬斯杜馬斯福林福林- -酚酚

6、原理原理裝置裝置溶劑溶劑時(shí)間時(shí)間靈敏度靈敏度干擾干擾總氮量總氮量蛋白氮蛋白氮總氮量總氮量蛋白氮蛋白氮?jiǎng)P式定氮裝置凱式定氮裝置分光光度計(jì)分光光度計(jì)高溫裝置、高溫裝置、GCGC分光光度計(jì)分光光度計(jì)濃硫酸濃硫酸用量較少用量較少不需要不需要福林福林- -酚試劑酚試劑長(zhǎng)長(zhǎng)簡(jiǎn)單快速簡(jiǎn)單快速3min3min簡(jiǎn)單快速簡(jiǎn)單快速較低較低低低高高高高較小較小有干擾有干擾較小較小酸類及檸檬酸類及檸檬酸類酸類染色法染色法紫外紫外吸收法吸收法水楊酸比色法水楊酸比色法采用凱氏定氮法測(cè)一樣品的粗蛋白含量，根據(jù)下列采用凱氏定氮法測(cè)一樣品的粗蛋白含量，根據(jù)下列記錄的數(shù)據(jù)計(jì)算：記錄的數(shù)據(jù)計(jì)算： 水份含量水份含量=8.0%，1 號(hào)樣

7、品重量號(hào)樣品重量=1.015g，2號(hào)樣品重號(hào)樣品重量量=1.025g，用于滴定的標(biāo)準(zhǔn)，用于滴定的標(biāo)準(zhǔn)HCl當(dāng)量濃度當(dāng)量濃度=0.1142N，1號(hào)樣品所用的號(hào)樣品所用的HCl溶液的毫升數(shù)溶液的毫升數(shù)=22.0ml，2號(hào)樣品的號(hào)樣品的HCl溶液的毫升數(shù)溶液的毫升數(shù)=22.5ml，空白的，空白的HCl溶液的毫升數(shù)溶液的毫升數(shù)=0.2ml，分別以樣品的干基和濕基計(jì)算粗蛋白質(zhì)含量，分別以樣品的干基和濕基計(jì)算粗蛋白質(zhì)含量，假定該蛋白質(zhì)含有假定該蛋白質(zhì)含有17.5%的氮。的氮。 氨基酸本身有堿性氨基酸本身有堿性-NH-NH2 2基，又有酸性基，又有酸性-COOH-COOH基，成中性內(nèi)鹽，加入甲醛溶液后，與基

8、，成中性內(nèi)鹽，加入甲醛溶液后，與-NH-NH2 2結(jié)結(jié)合，堿性消失，再用強(qiáng)堿來滴定合，堿性消失，再用強(qiáng)堿來滴定-COOH-COOH基。基。雙指示劑：百里酚酞雙指示劑：百里酚酞+中性紅指示劑中性紅指示劑二、非水溶液滴定法二、非水溶液滴定法三、電位滴定法三、電位滴定法 根據(jù)氨基的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿根據(jù)氨基的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示酸性，將酸度計(jì)的玻璃電極和甘汞性，使羧基顯示酸性，將酸度計(jì)的玻璃電極和甘汞電極同時(shí)插入被測(cè)液中構(gòu)成電池，用電極同時(shí)插入被測(cè)液中構(gòu)成電池，用NaOHNaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸度計(jì)指示的液滴定，根據(jù)酸度計(jì)指示的pH pH 值判斷和

9、控制滴定值判斷和控制滴定的的終點(diǎn)。終點(diǎn)。pH8.28.29 9.2.2 測(cè)某樣品中鐵元素的含量，稱樣測(cè)某樣品中鐵元素的含量，稱樣1.050g1.050g于坩堝中于坩堝中灰化，殘?jiān)孟∷崛芙夂蠖ㄈ葜粱一瑲堅(jiān)孟∷崛芙夂蠖ㄈ葜?00mL100mL，吸取，吸取5mL5mL樣液樣液于于25mL25mL容量瓶中顯色、定容、測(cè)定，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查容量瓶中顯色、定容、測(cè)定，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得樣液中鐵的含量為得樣液中鐵的含量為4.2g/mL4.2g/mL，請(qǐng)問該樣品中鐵元，請(qǐng)問該樣品中鐵元素的含量為多少？素的含量為多少？ 0.2% 在測(cè)定某廠醬油氨基酸態(tài)氮含量時(shí)，醬油在測(cè)定某廠醬油氨基酸態(tài)氮含量時(shí)，醬油5mg5mg于于100mL100mL容量瓶中，加水定容，混勻后吸取此液容量瓶中，加水定容，混勻后吸取此液20mL20mL進(jìn)行測(cè)定，用進(jìn)行測(cè)定，用0.05N0.05N氫氧化鈉滴定至氫氧化鈉滴定至pHpH值為值為8.28.2時(shí)，消耗標(biāo)準(zhǔn)堿液時(shí)，消耗標(biāo)準(zhǔn)堿液7.0mL, 7.0mL, 加入加入10.0mL10.0mL甲醛溶液，混勻。用標(biāo)準(zhǔn)溶液繼續(xù)滴定至甲醛溶液，混勻。用標(biāo)準(zhǔn)溶液繼續(xù)滴定至pH9.2pH9.2時(shí)，消耗標(biāo)準(zhǔn)堿液時(shí)，消耗標(biāo)準(zhǔn)堿液10.12mL,10.12mL,同法作空白實(shí)驗(yàn)，滴定至同法作空白實(shí)