淺論hVEGFA基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染效率的研究

1、淺論hVEGFA基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染效率的研究               作者：李慧勇， 袁志誠， 陳波， 陸培松， 李巧玉， 曹侃 【摘要】  目的： 應用AdEasy復制缺陷型腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建攜帶hVEGFA基因的重組腺病毒載體。方法： 采用分子克隆技術(shù)，從PCR2.1hVEGFA質(zhì)粒中克隆出hVEGFA基因的編碼序列，酶切、連接后，插入腺病毒系統(tǒng)中的穿梭載體pAdTrackCMV，獲得重組質(zhì)粒pAdTrackCMV

2、hVEGFA，將其轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架載體pAdeasy1的大腸埃希菌BJ5183，進行同源重組，獲得重組子pAdeasy1hVEGFA。鑒定后,將pAdeasy1hVEGFA轉(zhuǎn)染人胚腎細胞(HEK293A細胞)，獲得含hVEGFA基因的重組腺病毒(rAdhVEGFA)。反復感染HEK293A細胞擴增腺病毒，50%組織培養(yǎng)感染量法(TCID50)檢測病毒滴度，熒光顯微鏡觀測綠色熒光蛋白(GFP)的表達。結(jié)果： 成功構(gòu)建出含有hVEGFA基因的腺病毒載體rAdhVEGFA，轉(zhuǎn)染HEK293A細胞后出現(xiàn)綠色熒光蛋白表達，證明腺病毒載體rAdhVEGFA 轉(zhuǎn)染成功，通過反復感染HEK293A細胞獲得大

3、量病毒。結(jié)論： 成功構(gòu)建含有hVEGFA基因的腺病毒載體rAdhVEGFA，可為缺血性腦血管疾病的基因治療提供基因載體。 【關(guān)鍵詞】  hVEGFA基因; 腺病毒載體; 轉(zhuǎn)染; 缺血性腦血管疾病Abstract Objective: To construct the recombinant adenovirus vector containing hVEGFA gene. Methods: The hVEGFA gene coding sequence was cloned into pAdTrackCMV plasmid to get pAdTrackCMVhVEGFA , whi

4、ch would be transformed into competent E.coli BJ5183 carried backbone plasmid pAdeasy1 already. The homologous recombinant adenoviral plasmid was delivered into HEK293A cells after verification. The identified recombinant adenovirus (rAdhVEGFA) was amplified in HEK293A cells. Viral particle concentr

5、ation was determined by TCID50. Results: The recombinant adenovirus vector was constructed successfully. The expression of GFP was observed and the right gene was found. Conclusion: The recombinant adenoviral vector carrying hVEGFA gene was successfully constructed, and provided the basis of ischemi

6、c cerebrovascular diseases gene therapy.Key words hVEGFA gene; adenovirus vector; transfection; ischemic cerebrovascular disease (ICVD)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF )是Ferrara等在1989年從牛垂體濾泡星狀細胞的條件培養(yǎng)基中純化出來的一種具有肝素結(jié)合活性的生長因子,是在胚胎發(fā)生和創(chuàng)傷愈合過程中啟動血管形成的一個高度特異性的有絲分裂原,能特異性地作用于血管內(nèi)皮細胞,促進血管內(nèi)皮細胞增殖1

7、。VEGF治療缺血性腦損傷的研究具有重要的現(xiàn)實意義。本實驗利用重組腺病毒載體AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建含有hVEGFA基因的腺病毒載體rAdhVEGFA，以為缺血性腦血管疾病的基因治療提供基因載體。1 材料與方法1.1 材料和試劑PCR2.1hVEGFA質(zhì)粒由青島海洋研究所惠贈。TaKaRa TaqTM、pMDTM 18T載體和T4 DNA連接酶(TaKaRa公司);穿梭質(zhì)粒pAdtrackCMV、腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy1、大腸埃希菌DH5菌和BJ5183及HEK293A細胞由江蘇大學醫(yī)學技術(shù)研究所保存;Bgl 、Xho (TaKaRa公司); Pme 、Pac (NEB公司)，質(zhì)粒大、小量制

8、備試劑盒(AxyPrep公司); Lipofectamin 2000(Invirogen公司)。1.2 方 法1.2.1 目的基因hVEGFA的克隆上海生工生物技術(shù)有限公司合成引物，P1:5 CGCAGATCT ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG3;P2:5 AAGC TCGAG TCA CCG CCT CGG CTT GTC ACA3。以PCR2.1hVEGFA 質(zhì)粒為模板行PCR，退火溫度為60 ，PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，于長波紫外線透視儀下，切下大小為576 bp的hVEGFA的cDNA條帶，膠回收hVEGFA的cDNA片段。用普通DNA聚合酶進行加堿基

9、A尾延伸反應后，再用T4 DNA連接酶將hVEGFA cDNA與pMDTM 18T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細菌，涂在氨芐青霉素抗性 (終濃度為50 mg/ml)的LB平板上，置37 恒溫箱培養(yǎng)過夜。從每個培養(yǎng)皿上各挑取2個單克隆菌落分別接種于3 ml含氨芐青霉素抗性(終濃度為50 mg/ml) 的LB培養(yǎng)液中，置37 恒溫搖床(250 r/min)培養(yǎng)過夜。試劑盒提取質(zhì)粒,同時送至上海生物工程公司測序分析。從上、下游兩端進行核苷酸全序列分析，其結(jié)果經(jīng)生物信息學分析及BLAST軟件分析，以驗證重組質(zhì)粒的正確性。1.2.2 穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMVhVEGFA的構(gòu)建將pMDTM

10、18T載體hVEGFA用Bgl 和Xho 雙酶切，酶切產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠回收試劑盒回收576 bp的酶切產(chǎn)物，溶于蒸餾水備用。同時將穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV用Bgl 和Xho 雙酶切，酶切產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠回收試劑盒回收10 kb的酶切產(chǎn)物，溶于蒸餾水備用。用T4DNA連接酶將以上獲得的兩個酶切產(chǎn)物進行連接反應。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細菌，涂在卡那霉素抗性(終濃度為50 mg/ml)的LB平板上37 恒溫箱培養(yǎng)過夜。從每個培養(yǎng)皿上各挑取3個單克隆菌落接種于3 ml含卡那霉素抗性(終濃度為50 mg/ml)的LB培養(yǎng)液中，37 恒溫搖床(250

11、r/min)培養(yǎng)過夜。試劑盒提取質(zhì)粒, Bgl 、Xho 雙酶切鑒定陽性克隆, 同時送至上海生物工程公司測序分析。1.2.3 細菌內(nèi)同源重組構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒提取pAdTrackCMVhVEGFA質(zhì)粒, 取1 g用Pme 線性化，37 過夜。膠回收線性化的質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到含有腺病毒骨架載體pAdeasy1的BJ5183感受態(tài)細菌中, 在卡那霉素抗性的LB平板上培養(yǎng)1624 h，挑選較小的菌落培養(yǎng), 抽提質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳初篩重組體, 再用Pac 酶切鑒定。1.2.4 重組腺病毒的包裝和擴增鑒定正確的重組子轉(zhuǎn)化到DH5中后大量提取質(zhì)粒，Pac 線性化pAdTrackCMVAdEasy1hVEGFA

12、，乙醇、醋酸鈉沉淀，用體積分數(shù)為0.75的乙醇漂洗后，重新溶解在50 l滅菌的去離子水中。配制A液(質(zhì)粒DNA 6 g，加無血清DMEM至250 l)和B液(14 l Lipofectamin，加無血清DMEM稀釋至250 l)。A、B液混合，6 h后換含血清的培養(yǎng)液，4872 h左右見病毒感染細胞漂起，約90%以上293A細胞出現(xiàn)細胞病理效應(cytopathic effect, CPE)，同時觀測綠色熒光蛋白表達。收集上層細胞加1 ml無血清的DMEM，放-70 /38 反復凍融劇烈振蕩3次，12 000 r/min離心10 min，收集上清，再用同樣的方法感染293A，以擴增腺病毒數(shù)量。

13、每培養(yǎng)瓶加病毒液，第1次感染用500 l，第2次感染用50 l，第3次感染用5 l。制備的病毒液放于-70 凍存?zhèn)溆谩?.2.5 病毒感染滴度測定采用倍比稀釋法在96孔板中計算病毒滴度。按下列公式計算病毒滴度TCID50=101+d(s-0.5) ，再根據(jù)公式T=a×10bTCID50/ml=a×10b-0.7PFU/ml，將TCID50/ml換算成PFU/ml。1.2.6 重組腺病毒的鑒定取1l病毒上清，加入5 l蛋白酶K，55 反應1 h后水浴煮沸5 min。取1 l所得產(chǎn)物，PCR擴增hVEGFA基因。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。同樣處理空載體病毒Adenovi

14、rusmock。         2 結(jié) 果2.1 目的基因hVEGFA的克隆結(jié)果從PCR2.1hVEGFA質(zhì)粒中克隆出hVEGFA基因的編碼序列，見大小為576 bp的hVEGFA cDNA條帶(圖1)。M:DL2000標準參照物;V:hVEGFA圖1 hVEGFA序列的克隆2.2 穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMVhVEGFA的構(gòu)建和鑒定用Bgl 、Xho 雙酶切重組穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMVhVEGFA，瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果在750 bp和500 bp之間出現(xiàn)特異性條帶(圖2),與預期相符，初步證明VEGF基

15、因正確構(gòu)建到pAdTrackCMV中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pAdTrackCMVhVEGFA。將pAdTrackCMVhVEGFA交由上海生物工程公司測序分析，對外源插入片段從上、下游兩端進行核苷酸全序列分析。結(jié)果經(jīng)生物信息學分析及BLAST軟件分析，表明hVEGFA基因序列與基因庫中報告一致，表明重組穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMVhVEGFA構(gòu)建成功。M:DL2000標準參照物;Pt:pAdTrackCMVhVEGFA圖2 Bgl /Xho 雙酶切鑒定重組腺病毒質(zhì)粒pAdTrackCMVhVEGFAFig 2 Identification of pAdTrackCMVhVEGFA withB

16、gl and Xho restriction2.3 細菌內(nèi)同源重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定將上述穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)入攜帶腺病毒骨架pAdEasy1的BJ5183感受態(tài)細菌中，經(jīng)卡那霉素抗性篩選， 用Pac 酶切后可出現(xiàn)30 kb的大片段條帶和4.5 kb的特征性條帶(圖3)，表明重組腺病毒載體pAdTrackCMVAdEasy1hVEGFA構(gòu)建成功。圖3 Pac 酶切鑒定pAdTrackCMVAdEasy1hVEGFA2.4 重組腺病毒的包裝擴增與病毒滴度重組腺病毒DNA經(jīng)線性化后轉(zhuǎn)染293A細胞，在包裝的第2、5、8、11 天分別用倒置熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)熒光逐漸增多，證實病毒包裝成功(圖4)。將得到

17、的病毒繼續(xù)感染新的293A細胞，擴增病毒(圖5)。經(jīng)過4輪擴增,最終病毒的滴度達到2×1010 PFU/ml。圖4 轉(zhuǎn)染后293A細胞綠色熒光蛋白的表達(×200)圖5 重組腺病毒rAdhVEGFA的擴增(×200)2.5 重組腺病毒的鑒定1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，可見如圖1中一樣、大小為576 bp的hVEGFA的cDNA條帶。3 討 論缺血性腦血管疾病發(fā)病率有逐年增高趨勢,死亡率高,患者即使存活,也會留有嚴重的后遺癥。VEGF 是在胚胎發(fā)生和創(chuàng)傷愈合過程中啟動血管形成的一個高度特異性的有絲分裂原,能誘導血管生成、增加血管通透性及維持血管功能。VEGF還

18、有神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護的活性，VEGF介導的血管再生可以激發(fā)神經(jīng)干細胞增殖和分化，有利于神經(jīng)功能的恢復。VEGF有利于缺血性腦損傷的治療，靶點給予VEGF基因可阻止局部缺血性腦損傷。然而外源性的VEGF存在著反復給藥、易流失、效率低及難以在移植局部維持足夠濃度的缺點，如何使VEGF在局部穩(wěn)定、持續(xù)、高效地表達是研究的熱點。重組腺病毒載體是介導基因轉(zhuǎn)移和表達的重要工具之一。傳統(tǒng)的構(gòu)建腺病毒的方法有體外連接法和細胞內(nèi)同源重組法。前者在體外直接將目的基因連接到腺病毒骨架質(zhì)粒中,由于稀有酶切位點缺乏及大片段體外連接困難而存在技術(shù)困難，后者因細胞內(nèi)質(zhì)粒重組效率低,需反復空斑篩選而費時費力。改進的建立在大腸

19、埃希菌內(nèi)質(zhì)粒間同源重組方法之上的重組腺病毒載體AdEasy 系統(tǒng)免去了許多細胞內(nèi)的操作過程，極大地簡化了實驗步驟。大腸埃希菌BJ5183生長迅速，質(zhì)粒間同源重組效率高，且陽性克隆易于用抗生素篩選。腺病毒載體由人類腺病毒血清5型經(jīng)過基因工程修飾而得到，去除了病毒基因組中E1區(qū)和E3區(qū)。E1區(qū)是組裝感染性病毒顆粒所必需的結(jié)構(gòu)，被重新整合進包裝細胞HEK293。E3區(qū)基因編碼的蛋白為病毒復制非必需成分，與病毒逃避宿主的免疫有關(guān)。這些區(qū)域的缺失為在復制缺陷型重組腺病毒載體中插入外源基因提供了將近10 kb的空間。由于腺病毒載體感染靶細胞的范圍廣,能感染非分裂期的細胞,介導外源基因的表達效率高,且易于獲

20、得高滴度的病毒,因而較其他病毒載體具有更大優(yōu)勢，而且機體在初次接觸腺病毒后，會產(chǎn)生相應的病毒抗體，從而對腺病毒介導的基因治療產(chǎn)生耐受，在基因治療的研究中被廣泛應用。在本研究中，我們選用了腺病毒作為基因治療的載體，其表達時間可持續(xù)數(shù)月，免疫原性越來越低，并且其本身不整合入宿主細胞的基因組中，最有希望應用于臨床。本實驗中，由于攜帶目的基因hVEGFA的穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV多克隆位點兩側(cè)及腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy1基因組兩側(cè)均存在相同的同源序列,在大腸埃希菌BJ5183中很快實現(xiàn)同源重組，經(jīng)反復感染HEK293A細胞獲得了高效價重組腺病毒,病毒滴度在10101011 PFU/ml之間。本實驗為今后缺血性腦血管疾病的基因治療研究奠定了基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I】  1 Ferrara N,Henzel WJ.Pituitary follicular cells secrete a novel heparinbinding growth factor specific for vascular endothelial cells J. Biochem Biophys Res Commun, 1989,161(2): 851-858. Sun J, Sha B, Zhou WH, et al. VEGFmediated angiogenesis st