cDNA文庫構(gòu)建

1、cDNA文庫構(gòu)建cDNA文庫 原理 ：cDNA文庫不同于基因組文庫， 被克隆DNA是從mRNA反轉(zhuǎn)錄來源的 DNA CDNA組成特點(diǎn) 是其中不含有內(nèi)含子和其他調(diào)控序列。從而做cDNA克隆時(shí)應(yīng)是先從獲得 mRNA開始，在此基礎(chǔ)上，通過反轉(zhuǎn)錄酶作用產(chǎn)生一條與mRNA相互補(bǔ)的DNA鏈，然后除掉 mRNA以第一條DNA鏈為模板復(fù)制出第二條 DNA鏈(雙鏈)；再進(jìn)一步把此雙鏈插入原核或真核載體。cDNA文庫的構(gòu)建分為六個(gè)階段：階段1 :反轉(zhuǎn)錄酶催化合成 cDNA第一鏈階段2: cDNA第二鏈的合成階段3: cDNA的甲基化階段 4：接頭或銜接子的連接階段 5：Sepharose CL-4B 凝膠過濾法分

2、離 cDNA階段6: cDNA與入噬菌體臂的連接階段1:反轉(zhuǎn)錄酶催化合成 cDNA第一鏈1 在置于冰上的無菌微量離心管內(nèi)混合下列試劑進(jìn)行cDNA第 一鏈的合成:10poly(A) +RNA (1 卩 g/ 卩 I)寡核苷酸引物 (1 3 g/3 l)13l1moI/L Tris-HCI (pH8.0, 37C )2.53I1mol/L KCl3.53 I250 mmol/L MgCl 223ldNTP溶液（含4種dNTP每種 5mmol/L)103l0.1 mol/L DTT23lRNase抑制劑（選用）25單位加 H2O 至483l2 當(dāng)所有反應(yīng)組在 0C混合后，取出2.5卩I反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到另

3、一個(gè) 0.5ml微量離心管內(nèi)。在32這個(gè)小規(guī)模反應(yīng)管中加入0.1卩I a - P dCTP （400 Ci/mmol, 10mCi/ml ）。3 .大規(guī)模和小規(guī)模反應(yīng)管都在37 C溫育1h。4 .溫育接近結(jié)束時(shí)，在含有同位素的小規(guī)模反應(yīng)管中加入1卩I 0.25moI/L EDTA ，然后將反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到冰上。大規(guī)模反應(yīng)管則在70C溫育10 min，然后轉(zhuǎn)移至冰上。5.參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南 第三版附錄8所述方法，測定0.5卩l(xiāng)小規(guī)模反應(yīng)物中放射性 總活度和可被三氯乙酸（TCA沉淀的放射性活度。此外，用合適的DNA分子質(zhì)量參照物通過堿性瓊脂糖凝膠電泳對小規(guī)模反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析是值得的。6 .按下述方法

4、計(jì)算 cDNA第一鏈的合成量（推算方法略）：摻入的活度值（cpm）/總活度值X 66（卩g）=合成的cDNA第一鏈（卩g）7 .盡可能快地進(jìn)行 cDNA合成的下一步驟。階段2: cDNA第二鏈的合成1 .將下列試劑直接加入大規(guī)模第一鏈反應(yīng)混合物中：10 mmol/L MgCl 270卩 l2 mol/L Tris-HCI (pH7.4)5卩 l3210 mCi/mI a - P dCTP (400 Ci/mmol )10卩 I1 mol/L (NH 4)2SO1.5卩 lRNase H (1000 單位 /ml)1卩 l大腸桿菌DNA聚合酶I (10 000 單位/ml)4.5卩l(xiāng)溫和振蕩將上

5、述試劑混合，在微量離心機(jī)稍離心，以除去所有氣泡。在16C溫育24h。2溫育結(jié)束，將下列試劑加到反應(yīng)混合物中：3 -NAD (50 mmol/L)1卩 l大腸桿菌DNA連接酶(10004000單位/ml)1卩l(xiāng)室溫溫育 15min 。3 .溫育結(jié)束，加入1卩l(xiāng)含有4種dNTP的混合物和2卩l(xiāng) T4噬菌體DNA聚合酶。反應(yīng)混合物室溫溫育 15 分鐘。4 .取出3卩l(xiāng)反應(yīng)物，按步驟 7和8描述的方法測定第二鏈 DNA的質(zhì)量。5 .將5卩l(xiāng) 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)加入剩余的反應(yīng)物中，用酚：氯仿和氯仿分別抽提混合物一次。在 0.3 mol/L(pH5.2)乙酸鈉存在下，通過乙醇沉淀

6、回收DNA將DNA溶解在90 卩 l TE(pH7.6) 溶液中。6 .將下列試劑加到 DNA溶液中：10 X T4多核苷酸激酶緩沖液10卩l(xiāng)T4多核苷酸激酶(3000單位/ml )1卩l(xiāng)室溫溫育 15 分鐘。并按分子克隆實(shí)驗(yàn)指南 第三版附7.測定從上面步驟 4取出的3卩l(xiāng)反應(yīng)物中放射性活度,錄8所述方法測定1卩l(xiāng)第二鏈合成產(chǎn)物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。&用下面公式計(jì)算第二鏈反應(yīng)中所合成的cDNA量。要考慮到已摻入到 DNA第 一鏈種的dNTP 的量。第二鏈反應(yīng)中所摻入的活度值(cpm)/總活度值(cpm)*(66卩g -x卩g)=cDNA第二鏈合成量/卩gx表示cDNA第一鏈量

7、。CDNA第二鏈合成量通常為第一鏈量的7080%9 .用等量酚：氯仿對含有磷酸化cDNA（來自步驟6）的反應(yīng)物進(jìn)行抽提。10 Sephadex G-50 用含有 10 mmol/L NaCl 的 TE（pH7.6） 溶液進(jìn)行平衡，然后通過離子柱 層析將未摻入的 dNTP和cDNA分開。11. 加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2 ）和2倍體積的乙醇，沉淀柱層析洗脫下來的cDNA將樣品置于冰上至少15分鐘，然后在微量離心機(jī)上以最大速度4C離心15分鐘，回收沉淀DNA用手提微型監(jiān)測儀檢查，是否所有放射性都沉淀下來。12. 用 70%乙醇洗滌沉淀物，重復(fù)離心。13. 小心吸出所有液體，空

8、氣干燥沉淀物。14. 如果需要用 EcoR I甲基化酶對cDNA進(jìn)行甲基化，可將 cDNA溶解于80卩l(xiāng) TE（pH7.6）溶液中。另外，如果要將cDNA直接與Not I或Sal I接頭或寡核苷酸銜接子相連，可將cDNA懸浮在29卩l(xiāng) TE（pH7.6）溶液。沉淀的 DNA重新溶解后，盡快進(jìn)行 cDNA合成的 下一步驟。階段3: cDNA的甲基化1. 在cDNA樣品中加入以下試劑:2 mol/L Tris-HCl (pH8.0)5 mol/L NaCl0.5 mol/L EDTA(pH8.0)20 mmol/L S- 腺苷甲硫氨酸加 H2O 至5卩l(xiāng)2卩l(xiāng)2卩l(xiāng)1卩l(xiāng)96卩l(xiāng)2 .取出兩小份樣

9、品（各2卩l(xiāng) ）至0.5ml微量離心管中，分別編為1號和2號，置于冰上。3. 在余下的反應(yīng)混合液中加入2卩l(xiāng) EcoR I甲基化酶（80 000單位/ml ），保存在0C直至步驟 4 完成。4 .再從大體積的反應(yīng)液中吸出另外兩小分樣品（各2卩I ）至0.5ml微量離心管中，分別編為 3 號和 4 號。5. 在所有四小份樣品（來自步驟2和步驟4）加入100 ng質(zhì)粒DNA或 500 ng的入噬菌體D NA這些未甲基化的 DNA在預(yù)實(shí)驗(yàn)中用作底物以測定甲基化效率。6 .所有四份小樣實(shí)驗(yàn)反應(yīng)和大體積的反應(yīng)均在37 C溫育1h。7.于68C加熱15min，用酚：氯仿抽提大體積反應(yīng)液一次，再用氯仿抽提一

10、次。&在大體積反應(yīng)液中加入0.1倍體積的3 mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的乙醇，混勻后貯存于-20 C直至獲得小樣反應(yīng)結(jié)果。9. 按下述方法分析 4 個(gè)小樣對照反應(yīng)：a. 在每一對照反應(yīng)中分別加入：0.1 mol/L MgCl 22卩 l10X EcoR I緩沖液2卩l(xiāng)力口 H2O至20卩l(xiāng)b. 在 2 號和 4 號反應(yīng)管中分別加入 20 單位 EcoR I 。c. 四個(gè)對照樣品于 37C溫育1h,通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。10. 微量離心機(jī)以最大速度離心15min（4 C ）以回收沉淀cDNA棄上清，加入 200卩l(xiāng) 70% 乙醇洗滌沉淀，重復(fù)離心。11. 用手提式

11、微型探測器檢查是否所有放射性物質(zhì)均被沉淀。小心吸出乙醇，在空氣中晾 干沉淀，然后將 DNA溶于29卩l(xiāng) TE （ pH8.0 ）。12. 盡可能快地進(jìn)行 cDNA合成的下一階段。 階段 4：接頭或銜接子的連接 cDNA末端的削平 1. cDNA樣品于68 C加熱5 min。2 .將cDNA溶液冷卻至37 C并加入下列試劑:5X T4噬菌體DNA聚合酶修復(fù)緩沖液10卩IdNTP溶液，每種5 mmol/L5卩I力口 HO至50卩I3 .加入12單位T4噬菌體 DNA聚合酶（500單位/ml ）, 37 C溫育15min。4. 加入 1卩 I 0.5moI/L EDTA（pH8.0），以終止反應(yīng)。5

12、用酚:氯仿抽提，再通過Sephadex G-50 離心柱層析，除去未摻入的dNTP。6 .在柱流出液中加入 0.1倍體積的3 moI/L 乙酸鈉（pH5.2）和二倍體積的乙醇，樣品于4 C 至少放置 15 min 。7.在微量離心機(jī)上以最大速度離心15 min（4 C），回收沉淀的cDNA沉淀經(jīng)空氣干燥后溶于 131 I的 10 mmoI/L Tris-HCI (pH8.0).接頭-銜接子與cDNA的連接&將下列試劑加入到已削成平末端的DNA中:10 X T4噬菌體DNA聚合酶修復(fù)緩沖液2 卩I8001000 ng的磷酸化接頭或銜接子2 卩IT4噬菌體 DNA連接酶（105 Weiss

13、單位/ml）1卩I10 mmol/L ATP2卩 I混勻后，在16C溫育812h。9. 從反應(yīng)液中吸出 0.5I貯存于4C,其余反應(yīng)液于 68C加熱15min以滅活連接酶。 階段 5: Sepharose CL-4B 凝膠過濾法分離 cDNASepharose CL-4B 柱的制備1用帶有彎頭的皮下注射針頭將棉拭的一半推進(jìn)1ml 滅菌吸管端部，用無菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并棄去，再用濾過的壓縮空氣將余下的棉拭子吹至吸管狹窄端。2將一段無菌的聚氯乙烯軟管與吸管窄端相連，將吸管寬端浸于含有0.1 mol/L NaCl 的 TE(pH7.6 )溶液中。將聚氯乙烯管與相連于真空裝置的錐瓶相接。輕緩抽

14、吸，直至吸管 內(nèi)充滿緩沖液，用止血鉗關(guān)閉軟管。3在吸管寬端接一段乙烯泡沫管，讓糊狀物靜置數(shù)分鐘，放開止血鉗，當(dāng)緩沖液從吸管滴 落時(shí)，層析柱亦隨之形成。如有必要，可加入更多的Sepharose CL-4B ，直至填充基質(zhì)幾乎充滿吸管為止。4將幾倍柱床體積的含 0.1 mol/L 氯化鈉的 TE(pH7.6) 洗滌柱子。洗柱完成后，關(guān)閉柱子底部的軟管。依據(jù)大小分離回收 DNA5 .用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose CL-4B 上層的液體，將 cDNA加到柱上(體積 50卩I或更小)，放開止血鉗，使cDNA進(jìn)入凝膠。用 50卩I TE(pH7.6)洗滌盛裝cDNA的微量離心管，將洗液亦加于柱上

15、。用含 0.1 moI/L NaCI 的 TE(pH7.6) 充滿泡沫管。6. 用手提式小型探測器監(jiān)測cDNA流經(jīng)柱子的進(jìn)程。放射性cDNA流到柱長2/3時(shí)，開始用微量離心管收集，每管 2 滴，直至將所有放射性洗脫出柱為止。7. 用切侖科夫計(jì)數(shù)器測量每管的放射性活性。&從每一管中取出一小份，以末端標(biāo)記的已知大小 (0.2kb5kb )的DNA片斷作標(biāo)準(zhǔn)參照物，通過1%瓊脂凝膠電泳進(jìn)行分析，將各管余下部分貯存于-20 C,直至獲得瓊脂糖凝膠電泳的放射自顯影片。9 .電泳后將凝膠移至一張Whatman 3MM濾紙上，蓋上一張 Saran包裝膜，并在凝膠干燥器上干燥。干燥過程前20min至3

16、0min于50 C加熱凝膠，然后停止加熱，在真空狀態(tài)繼續(xù) 干燥 12h.10. 置-70 C加增感屏對干燥的凝膠繼續(xù)X射線曝光。11. 在cDNA長度500bp的收集管中，加入 0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉(pH5.2 )和二倍 體積的乙醇。于 4C放置至少15min使cDNA沉淀，用微量離心機(jī)于 4C以12 000g離心 15min，以回收沉淀的 cDNA12. 將 DNA溶于總體積為 20 卩 I 的 10 mmol/L Tris-HCI（pH7.6） 中。13. 測定每一小份放射性活度。算出選定的組分中所得到的總放射性活度值。計(jì)算可用于入噬菌體臂相連接的 DNA總量。選定組分的總活度

17、值（cpm）/摻入到第二鏈的活度值（cpm）*2x卩g cDNA第二鏈合成量= 可用于連接的 cDNA階段6: cDNA與入噬菌體臂的連接1 .按下述方法建立 4組連接-包裝反應(yīng):連接A（卩 l）B（卩 l）C（卩 l）D（卩 l）入噬菌體 DNA（0.5卩g/卩l(xiāng)）1.01.01.01.010 X T4DNA連接酶緩沖液1.01.01.01.0cDNA0 ng5 ng10 ng50 ng5T4噬菌體 DNA連接酶（10 Weiss單位/ml ）0.10.10.10.110 mmol/L ATP1.01.01.01.0加HO至10101010連接混合物于16C培育416h。剩余的cDNA儲(chǔ)存于-20 C。2. 按包裝提取物廠商提供的方法，從每組連接反應(yīng)物中取5卩l(xiāng)包裝到噬菌體顆粒中。3 .包裝反應(yīng)完成后，在各