激光掃描共聚焦顯微鏡的原理和應(yīng)用

1、激光掃描共聚焦顯微鏡的原理和應(yīng)用一、激光掃描共聚焦顯微鏡的原理傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡使用的是場光源，標(biāo)本上每一點的圖像都會受到鄰近點的衍射或散射光的干擾；激光掃描共焦顯微鏡 (Laser Sea nning Co nfocal Microscope，LSCM采用點光源照射樣本，在焦平面上形成一個輪廓清楚的小的 光點，該點被照射后發(fā)出的熒光被物鏡搜集，并沿原照射光路回送到由雙色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔， 分別稱為照明針孔和探測針孔。照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛 的,焦平面上的點同時聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔，焦平面以外的點被擋在探測針孔之外不

2、能成像，這樣得到的共聚焦圖像是標(biāo)本的光學(xué)切面， 防止了非焦平面 上雜散光線的干擾，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點，因此能得到整個焦平面 上清晰的共聚焦圖像。原理圖L4W 1激光掃描共聚焦顯微鏡組成特點LSCM由顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)，激光光源，掃描裝置和檢測系統(tǒng)構(gòu)成，整套儀器由計算機控制，各部件之間的操作切換都可在計算機操作平臺界面中方便靈活地進行。顯微鏡是LSCM勺主要組件，它關(guān)系到系統(tǒng)的成像質(zhì)量。通常有倒置和正置兩種形式，前者在切片、活細(xì)胞檢測等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中使用更廣泛。三、激光掃描共聚焦顯微鏡的應(yīng)用一細(xì)胞的三維重建普通熒光顯微鏡分辨率低，顯示的圖像結(jié)構(gòu)為多層面的圖像疊加，結(jié)構(gòu)不夠 清晰。LSC礎(chǔ)

3、以0.1卩m的步距沿軸向?qū)?xì)胞進行分層掃描， 得到一組光學(xué)切片, 經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換后作為二維數(shù)組貯存。這些數(shù)組通過計算機進行不同的三維重建算 法，可作單色或雙色圖像處理，組合成細(xì)胞真實的三維結(jié)構(gòu)。旋轉(zhuǎn)不同角度可觀 察各側(cè)面的外表形態(tài)，也可從不同的斷面觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，測量細(xì)胞的長寬高、 體積和斷層面積等形態(tài)學(xué)參數(shù)。通過模擬熒光處理算法，可以產(chǎn)生在不同照明角 度形成的陰影效果，突出立體感。通過角度旋轉(zhuǎn)和細(xì)胞位置變化可產(chǎn)生三維動畫 效果。LSCM勺三維重建廣泛用于各類細(xì)胞骨架和形態(tài)學(xué)分析、染色體分析、細(xì) 胞程序化死亡的觀察、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)變化的分析和探測等方面。二靜態(tài)結(jié)構(gòu)檢測1. 細(xì)胞原位

4、檢測核酸用于細(xì)胞核定位及其形態(tài)學(xué)觀察、檢測細(xì)胞內(nèi)DNA勺復(fù)制及斷裂情況以及染 色體定位觀察。2. 原位檢測蛋白質(zhì)、抗體及其他分子原位檢測蛋白質(zhì)、抗體及其他分子免疫熒光標(biāo)記技術(shù)檢測熒光蛋白3. 檢測細(xì)胞凋亡檢測細(xì)胞凋亡不同時期細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白4. 細(xì)胞器觀察及測定探針可以直接跨過死細(xì)胞或活細(xì)胞膜，選擇性地與特定細(xì)胞器結(jié)合5. 檢測細(xì)胞融合6. 觀察細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)7.觀察細(xì)胞間縫隙連接通訊8.檢測細(xì)胞內(nèi)脂肪：尼羅紅檢測動物組織中或體外培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)脂滴含量三動態(tài)觀察：活體細(xì)胞或組織功能的實時動態(tài)檢測1. 實時定量測定細(xì)胞內(nèi)鈣的變化鈣離子濃度測定和比率成像2. 測定細(xì)胞內(nèi)PH變化同一種探針BCECF分別用不同激發(fā)峰激發(fā)得到的熒光比例，探究PH變化3. 檢測膜電位的變化JC-1低電位下單體存在，發(fā)綠色熒光；高電位下 J-聚集體，發(fā)紅色熒光，隨 電位增加，紅色熒光也增加4. 檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧物種的產(chǎn)生5. 藥物篩選檢測藥物等跨膜進入組織或細(xì)胞過程及定位；對藥物、病毒、細(xì)菌等熒光標(biāo)記，檢測是否進入、位置含量、動態(tài)過程；6. 檢測熒光共振能量轉(zhuǎn)移-FRETGFP和YFP BFP和GFP等研究大分子間的相互作用7囊泡運輸研究利用胞吞/胞吐探針FM4-64,結(jié)合激光共聚焦、電鏡、TIRF,檢測囊泡的運動 過程，探討B(tài)FA對胞吞/胞吐過程的影響。8.