iNOS抑制劑對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)組織膠原表達(dá)的影響

1、iNOS抑制劑對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)組織膠原表達(dá)的影響 作者：孫煒 王吉興 金大地 劉曉霞 劉安慶【摘要】 目的 觀察誘導(dǎo)型一氧化氮合酶抑制劑對(duì)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)組織膠原表達(dá)的影響。方法 24只新西蘭大白兔雙側(cè)股骨髁間關(guān)節(jié)面造成全層軟骨缺損。隨機(jī)抽簽均分為對(duì)照組、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)組和一氧化氮合酶抑制劑S²甲基異硫脲組(S²methylisothiourea，SMT)組。術(shù)后1年處死動(dòng)物。應(yīng)用苦味酸²天狼猩紅染色檢測(cè)膠原的分布情況，圖像分析技術(shù)定量膠原的表達(dá)及進(jìn)行修復(fù)組織軟骨厚度的測(cè)量。應(yīng)用免

2、疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)型膠原的表達(dá)和分布。結(jié)果 圖像分析顯示，1年后SMT組型膠原表達(dá)量為65.9，明顯少于BMP組88.5和對(duì)照組94.6的表達(dá)量，型膠原30.7的表達(dá)量明顯多于BMP組10.8和對(duì)照組4.5的表達(dá)量。1年后SMT組軟骨厚度(1.85±0.56) mm明顯高于BMP組(0.67±0.31) mm和對(duì)照組(0.24±0.10) mm。SMT組缺損區(qū)型膠原含量明顯高于BMP組和對(duì)照組。結(jié)論 iNOS抑制劑SMT的應(yīng)用能明顯增加型膠原表達(dá)和軟骨厚度，對(duì)于維持軟骨表型有積極意義。 【關(guān)鍵詞】 一氧化氮酶 抑制劑 軟骨 S²甲基異硫脲 膠原

3、Abstract：Objective To discuss effect of collagen expression in articular cartilage repaire tissue by inducible nitric oxide synthase inhibitor SMT.Methods Full²thickness defects of cartilage were created in the trochlear groove of twenty²four adult New Zealand White rabbits.eight d

4、efects were empty，eight were filled with a collagen fibrin glue impregnated with rhBMP，eight were filled with a collagen fibrin glue impregnated with rhBMP and hypodermic injection with 5 mg/kg²1/12 h²1 SMT.The animals were killed at one²year postperatively.The tissue sect

5、ions were stained with Sirius²Red against collagen type²and type²which analyzed by Quantiment 500.Cartilage thickness was measured by Quantiment 500 too.Results One²year after collagen fibrin glue with rhBMP and with hypodermic injection SMT，collagen type&sup2

6、; expression of repair tissue in SMT group(65.9) was less than in BMP group(88.5) and the control(94.6)，and collagen type² (30.7) was more than in BMP group(10.8) and the control(4.5).Cartilage thickness of SMT group(1.85±0.56) mm was significant higher than BMP group(0.67±0.31) m

7、m and the control(0.24±0.10) mm.Conclusion NOS inhibitor SMT could increase collagen type²expression and decrease collagen type²expression，as well as make phenotype good. Key words：nitric oxide synthase；inhibitor；cartilage；s²methylisothiourea；collagen 一氧化氮(nitric oxid

8、e，NO)是活潑的自由基分子，參與多種組織的代謝調(diào)節(jié)。關(guān)節(jié)軟骨自身修復(fù)能力十分有限，關(guān)節(jié)軟骨損傷通常會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的關(guān)節(jié)軟骨退變，既往研究已采用多種方法來修復(fù)和重建關(guān)節(jié)軟骨，許多技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于臨床。而一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS) 抑制劑有助于軟骨組織修復(fù)。因此本文應(yīng)用苦味酸²天狼猩紅染色，研究軟骨修復(fù)組織中膠原纖維的表達(dá)變化，了解NOS抑制劑對(duì)軟骨修復(fù)組織膠原表達(dá)的影響。 1 材料與方法 1.1 研究對(duì)象與實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)于1999年6月至2001年2月在南方醫(yī)科大學(xué)完成。取8個(gè)月齡新西蘭兔24只，雄性，體重(2.5±0.2)

9、kg。隨機(jī)抽簽法分為對(duì)照組、骨形態(tài)發(fā)生蛋白組(bone morphogentic protein，BMP)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶抑制劑S²甲基異硫脲(S²methylisothiourea，SMT)組，動(dòng)物由南方醫(yī)科大學(xué)提供。 動(dòng)物模型和標(biāo)本處理：8月齡新西蘭兔24只，隨機(jī)分為對(duì)照組、BMP組和SMT各8只。在右側(cè)股骨髁間關(guān)節(jié)面上作直徑4.5 mm、深達(dá)髓腔的全層缺損。a)對(duì)照組：軟骨缺損不充填任何物質(zhì)；b)BMP組：缺損用BMP纖維蛋白凝膠復(fù)合物充填；c)SMT組：缺損應(yīng)用膠原復(fù)合BMP充填，術(shù)后按5 mg·kg1·12 h1皮下注射SM

10、T。術(shù)后1年各組處死動(dòng)物，制作石蠟切片用于檢測(cè)。 1.2 苦味酸²天狼猩紅染色顯示膠原分布：石蠟切片，0.1的天狼猩紅飽和苦味酸溶液(0.1 g天狼猩紅溶于100 mL苦味酸溶液)染60 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。偏振光顯微鏡下觀察。 1.3 軟骨、型膠原圖像分析 在40倍視野下，每張切片上選擇10個(gè)縱向視野，以正常軟骨、型膠原色度為參照。利用LeicaQ500MC圖像分析儀，在交互式操作方式下進(jìn)行測(cè)試，獲得關(guān)于膠原的體視學(xué)定量指標(biāo)。將獲得的體視學(xué)參數(shù)值按體視學(xué)原理和計(jì)算公式求得每例標(biāo)本的形態(tài)學(xué)定量參數(shù)值，得到各型膠原含量。軟骨厚度圖像分析：利用LeicaQ50

11、0MC圖像分析儀，100倍視野下測(cè)量修復(fù)組織表面型膠原顯示的厚度來間接測(cè)量軟骨厚度。 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS 8.0軟件包完成統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)值均以±s表示，Paired²samples T test作均數(shù)的顯著性檢驗(yàn)。 2 結(jié) 果 2.1 偏振光顯微鏡下觀察 在偏振光顯微鏡下，型膠原表現(xiàn)為較強(qiáng)的雙折光，緊密排列，為黃色或紅色的纖維。型膠原顯示弱的雙折光，呈現(xiàn)綠色混合顏色的疏松纖維。術(shù)后1年，對(duì)照組修復(fù)組織內(nèi)基本未見綠色纖維，以致密粗大黃色纖維為主，與軟骨下骨結(jié)構(gòu)也有明顯差別；術(shù)后1年，BMP組基本以黃色和紅色纖維為主，中間夾雜很少量綠色弱折光纖維；術(shù)后1年，SM

12、T組仍可見大量綠色弱折光纖維，但局部有異位骨化。 2.2 軟骨修復(fù)組織/膠原分布圖像分析結(jié)果 經(jīng)圖像分析，SMT組術(shù)后1年型膠原占65.9，型膠原30.7。分別與對(duì)照組型膠原(94.6)、BMP組型膠原(88.5)，對(duì)照組型膠原(4.5)、BMP組的型膠原(10.8)相比，差異有顯著性意義(P0.05)(見表1)。表1術(shù)后1年軟骨修復(fù)組織、膠原分布和厚度比較注：與對(duì)照組和BMP組相比，*P0.05。 2.3 軟骨厚度的測(cè)量 經(jīng)圖像分析，1年后SMT組軟骨厚度(1.85±0.56) mm明顯高于BMP組(0.67±0.31) mm及對(duì)照組(0.24±0.10) mm

13、，其差異有顯著性意義(P0.05)(見表1)。 3 討 論 NO作為體內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子，已證實(shí)在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病和轉(zhuǎn)歸方面有重要作用。我們以前的研究也提示iNOS抑制劑SMT能提高軟骨修復(fù)組織的質(zhì)量1，2，但由于技術(shù)的原因，均未能對(duì)軟骨修復(fù)組織內(nèi)膠原變化，特別是型和型膠原作定量分析，以闡明修復(fù)組織膠原的變化規(guī)律，從而提高修復(fù)組織質(zhì)量。天狼猩紅是陰離子強(qiáng)酸染料，易與膠原纖維中的堿性基團(tuán)反應(yīng)。膠原纖維在偏振光下有正的單軸雙折光屬性，與天狼猩紅結(jié)合可增強(qiáng)雙折射，提高分辨率3。Junqueira等4最早將苦味酸²天狼猩紅染色法應(yīng)用于組織切片的膠原檢測(cè)，國內(nèi)也曾用于纖維表達(dá)等方面的研究

14、5，6。 既往研究雖然采用了多種方法促進(jìn)軟骨修復(fù)，許多報(bào)告均能在早期獲得缺損區(qū)透明軟骨的生成。但是這些修復(fù)組織無論是在生物學(xué)結(jié)構(gòu)和形態(tài)方面，還是生物力學(xué)方面，均與正常軟骨不同。而且這些修復(fù)軟骨組織較差的功能及耐用性，隨后導(dǎo)致退行性退變，被纖維組織代替7、8。型膠原是軟骨組織最主要的成分，可作為軟骨的表型標(biāo)記，決定了關(guān)節(jié)軟骨特性，是評(píng)價(jià)軟骨修復(fù)質(zhì)量的標(biāo)志之一。既往采用免疫組化技術(shù)不僅抗體來源不易，價(jià)格昂貴，操作費(fèi)時(shí)，而且只能在不同切片上觀察膠原的分布情況。而苦味酸²天狼猩紅染色法可以在一張切片上同時(shí)顯示出各種膠原的分布及其相互的關(guān)系，有利于觀察軟骨修復(fù)過程中各種膠原變化的規(guī)律。

15、隨著計(jì)算機(jī)分析技術(shù)的成熟，根據(jù)不同的顏色和灰度定量分析膠原分布成為可能。我們首次采用苦味酸²天狼猩紅染色法并與病理體視學(xué)方法結(jié)合，檢測(cè)軟骨修復(fù)組織中型和型膠原的分布，以觀察一氧化氮合酶抑制劑SMT對(duì)軟骨表型維持的影響。但天狼猩紅染色對(duì)于區(qū)分型和型膠原尚不理想，我們采用正常軟骨的型膠原為基準(zhǔn)來校正軟骨修復(fù)組織中型膠原，以此區(qū)分型膠原。同時(shí)，軟骨修復(fù)中型膠原的表達(dá)較少。圖像分析結(jié)果顯示，SMT組軟骨修復(fù)組織在術(shù)后1年型膠原明顯少于BMP組和對(duì)照組，型膠原多于BMP組和對(duì)照組。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，SMT的應(yīng)用對(duì)維持軟骨修復(fù)組織的表型方面具有積極作用。但軟骨的修復(fù)組織與正常軟骨相比仍然

16、有一定差距，尤其是異位骨化及接合處的退變。但苦味酸²天狼猩紅染色法無疑是一種觀察軟骨修復(fù)組織中膠原類型、分布、含量及變化較理想的方法?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Vuolteenaho K，Moilanen T，Knowles RG，et al.The role of nitric oxide in osteoarthritisJ.Scand J Rheumatol，2007，36(4)：247²58.2孫煒，王吉興，金大地，等.一氧化氮合酶抑制劑長期作用對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的影響J.中華醫(yī)學(xué)雜志，2002，82(1)：23²26.3周明芳，程天民，馮

17、正直.抑郁對(duì)大鼠創(chuàng)面愈合過程中膠原含量的影響J.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30(13)：1293²1295.4Junqueira LC，Cossermlli W，Brentani R.Differential staining of collagens of type ， and by Sirius Red and polarization microscopyJ.Arch HistolJpn，1978，41(3)：267²274.5姬文婕，周欣，楊磊.天狼猩紅²偏振光法觀察染石英小鼠肺組織膠原纖維的動(dòng)態(tài)變化J.中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2004，22(5)：361²363.6韓曉梅，趙堪興.人眼直肌Pulley系統(tǒng)膠原成分的實(shí)驗(yàn)研究J.眼科新進(jìn)展，2007，27(10)：721²724.7Peterson L，Brittberg M，Kiviranta I，et al.Autolo