不同劑量rhBMP2對(duì)兔下頜骨牽引成骨區(qū)新骨生成的影響及其OPG表達(dá)

1、不同劑量rhBMP-2對(duì)兔下頜骨牽引成骨區(qū)新骨生成的影響及其OPG表達(dá)【摘要】 目的 研究不同濃度rhBMP-2在不同時(shí)間對(duì)兔下頜骨牽引成骨區(qū)新骨生成的影響及牽引區(qū)新骨中骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）的表達(dá)。方法 在48只成年大耳白兔的一側(cè)下頜骨前部行骨切開術(shù)，分別將空白膠原、rhBMP-2 1.5 mg和rhBMP-2 3 mg膠原復(fù)合物植入下頜骨切開處，用牽引器延長(zhǎng)一側(cè)下頜骨4 mm，穩(wěn)定期第1、3、7、14天，分別處死各組動(dòng)物，取牽引區(qū)新生骨痂行OPG免疫組化染色。結(jié)果 下頜牽引延長(zhǎng)后牽引間隙均有新骨形成，免疫組化染色OPG主要定位于成骨細(xì)胞的胞漿中。在同一時(shí)間內(nèi)，應(yīng)

2、用rhBMP-2組較對(duì)照組有顯著性差異(P0.05)，且rhBMP-2 3 mg劑量組較rhBMP-2 1.5 mg劑量組有顯著性差異(P0.05)。結(jié)論 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，rhBMP-2能促進(jìn)兔下頜骨牽引成骨區(qū)新骨的生成并具有濃度依賴性。 【關(guān)鍵詞】 牽引成骨 rhBMP-2 骨保護(hù)素Abstract：Objective To investigate the Effects of different concentrations of rhBMP-2 on mandibular distraction osteogenesis and the expression of OPG in the p

3、eriod of distraction osteogenesis. Methods Unilateral mandibular osteotomies were performed in 48 mature rabbit, 1.5 mg rhBMP-2 or 3 mg rhBMP-2 with the collagen carrier were implanted in the osteotomy side of mandibles.Only collagen sponge was implanted in control group.the mandibles of 48 rabbits

4、were lengthened by 4 mm using a distractor , The animals were killed on 1,3,7,14 days of consolidation period. The distracted calluses were harvested and processed for immunohistochemistry study of OPG. Results The regenerated bone was found in the distraction gap after mandibular lengthening. Stain

5、ing of OPG was localized in osteoblasts cell of the periosteal region after completion of distraction. The mandibular side treated with 1.5 mg rhBMP-2 gained greater amount of new bone formation than treated with collagen sponge，and the mandibular side treated with 3 mg rhBMP-2 harvested greater amo

6、unt of new bone formation than treated with 1.5 mg rhBMP-2. OPG expression was found in the cytoplasm of osteoblasts and stained brown or dark brown by immunohistochemistry. In the mean time，OPG expression indicated there was siganificant difference between rhBMP-2 group and control group(P0.05)，and

7、 3 mg rhBMP-2 group had siganificant difference comparing with 1.5 mg rhBMP-2 group (P0.05). Conclusions The animal experiment shows rhBMP-2 could accelerate bone formation of mandibular distraction osteogenesis in rabbit and was concentration-dependent.rhBMP-2 could increase the expression of OPG.

8、Key words：mandibular osteo-distraction；recombinant human morphogenetic protein2；osteoprotegerin 牽引成骨（distraction osteogenesis，DO）近年來(lái)已成為矯治顱頜面先天和后天性骨骼發(fā)育不足及整復(fù)頜骨缺損的一個(gè)重要手段。目前，如何應(yīng)用外源性生長(zhǎng)因子來(lái)加速牽引后新骨愈合，縮短牽引成骨時(shí)間，是這一技術(shù)中的研究熱點(diǎn)。本研究旨在通過兔下頜骨DO實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，研究不同劑量rhBMP-2對(duì)兔下頜骨牽引成骨區(qū)新骨生成的影響及其骨保護(hù)素(osteoproterin，OPG)的表達(dá)，探索rhBMP-

9、2促進(jìn)牽引成骨區(qū)新骨生成的機(jī)制、rhBMP-2的最佳有效劑量及兔下頜骨DO中加入外源性rhBMP-2對(duì)牽引成骨區(qū)新骨生成的作用，以縮短DO療程、減少并發(fā)癥和減輕患者痛苦，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。 材料與方法1.1 材料兔下頜骨牽引器（西安中邦公司加工制作）日本大耳白兔48只（遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。ABC免疫組化試劑盒和OPG多克隆抗體均購(gòu)自武漢博士德試劑公司。1.2 實(shí)驗(yàn)方法選健康成年大耳白兔48只，體重3.03.5 kg，隨機(jī)分3組，每組16只，選取一側(cè)下頜骨為實(shí)驗(yàn)側(cè)，另一側(cè)為對(duì)照組（Control group）。全麻平穩(wěn)后于兔下頜骨下緣行水平切口，分離組織顯露下頜骨。下頜骨截?cái)嗪蟀仓脿?/p>

10、引器，骨膜下植入不含rhBMP-2膠原海綿載體；第一實(shí)驗(yàn)組（Group 1）下頜骨截?cái)嗪蟀仓脿恳?，牽引區(qū)骨膜下植入含1.5 mg rhBMP-2的膠原海綿載體；第二實(shí)驗(yàn)組（Group 2）下頜骨截?cái)嗪蟀仓脿恳?，牽引區(qū)骨膜下植入含3 mg rhBMP-2的膠原海綿載體。經(jīng)過5 d的間歇期后，以0.8 mm/d,0.4 mm/次的牽引速度牽引，每次間隔12 h，向前緩慢延長(zhǎng)下頜骨，連續(xù)牽引5 d，即延長(zhǎng)下頜骨4 mm后固定牽引器。1.3 標(biāo)本獲取與處理在牽引結(jié)束后的第1、3、7、14天后分別處死各組所有動(dòng)物，取牽引處下頜骨骨痂入4 %多聚甲醛溶液中固定24 h，EDTA脫鈣后，乙醇逐級(jí)脫水，石

11、蠟包埋，作5 m厚連續(xù)切片。1.4 免疫組化染色與分析將切片用免疫組化ABC法檢測(cè)單側(cè)下頜牽引區(qū)新生骨組織中的OPG的表達(dá)。以1100的OPG抗體工作濃度進(jìn)行免疫組化染色，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，胞漿棕色顆粒為這種細(xì)胞因子OPG的陽(yáng)性信號(hào)。1.5 統(tǒng)計(jì)方法用SPSS軟件，采用多重比較的方差分析。2 結(jié) 果 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一側(cè)下頜骨均被成功延長(zhǎng)，處死動(dòng)物時(shí)見牽引間隙有新生骨痂形成。 穩(wěn)定期第1天：對(duì)照組OPG在成骨樣細(xì)胞及其前體細(xì)胞中呈陽(yáng)性染色（圖1）；Group 1組OPG在增殖活躍的成骨樣細(xì)胞胞漿中呈陽(yáng)性染色（圖2）；Group 2組OPG在大量明顯沿牽引方向排列的成骨樣細(xì)胞胞漿中呈陽(yáng)性

12、染色（圖3）。 穩(wěn)定期第3天：3組中OPG在成骨樣細(xì)胞及其前體細(xì)胞的胞漿中均有表達(dá)，其中Group 2組表達(dá)的較多。 穩(wěn)定期第7天：對(duì)照組、Group 1組和Group 2組少量骨小梁表面附著的成骨細(xì)胞可見OPG陽(yáng)性著色，在Group 2組骨小梁周圍的纖維結(jié)締組織間質(zhì)內(nèi)也有少許著色。 穩(wěn)定期第14天：對(duì)照組在增多的骨小梁周邊的成骨細(xì)胞胞漿內(nèi)染色，Group 1組圍繞骨小梁周邊的成骨細(xì)胞內(nèi)少許OPG染色，Group 2組在較成熟的骨小梁周圍骨基質(zhì)出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)染色很弱。表1 各組牽引區(qū)表達(dá)OPG的陽(yáng)性細(xì)胞率（略）注：* 表示在同一時(shí)間內(nèi)，該組與對(duì)照組比較有顯著性差異（P0.05），*表示該組與對(duì)照

13、組比較有高度顯著性差異（P0.01）； 表示該組與Group 1比較有顯著性差異（P0.05）表中數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析結(jié)果表明，在同一時(shí)間內(nèi)，隨著rhBMP-2劑量的增加，牽引區(qū)表達(dá)OPG陽(yáng)性細(xì)胞率逐漸增多。Group 1組陽(yáng)性細(xì)胞率增多與對(duì)照組有顯著性差異(P0.05)，Group 2組陽(yáng)性細(xì)胞率進(jìn)一步增多與對(duì)照組有高度顯著性差異(P0.01)且Group 2組陽(yáng)性細(xì)胞率與Group 1組有顯著性差異(P0.05)；在同一劑量下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)陽(yáng)性率逐漸下降。穩(wěn)定期第1天陽(yáng)性細(xì)胞率與穩(wěn)定期第3天有顯著性差異(P0.05)；穩(wěn)定期第3天陽(yáng)性細(xì)胞率減少，高于穩(wěn)定期第7天（P0.05)；穩(wěn)定期第7天陽(yáng)性

14、細(xì)胞率進(jìn)一步減少，高于穩(wěn)定期第14天(P0.05)。 3 討論 盡管DO已在矯治顱面骨發(fā)育不全和唇腭裂術(shù)后繼發(fā)畸形等方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)1-3，但其較長(zhǎng)的療程及其并發(fā)癥是目前限制該技術(shù)在臨床進(jìn)一步應(yīng)用的重要因素。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者正致力于探索各種方法和措施促進(jìn)牽引后新骨生成和改建，以期達(dá)到縮短療程和獲取高質(zhì)量牽引成骨效果的目的。 正常的骨折愈合過程依賴于骨吸收和骨形成過程的動(dòng)態(tài)平衡，而這一過程又分別與破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)和成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)的功能密切相關(guān)，OPG能顯著抑制OC的分化、增殖和骨吸收功能4。BMP-2的成骨作用已被大量的研究證實(shí)，在DO早期，BM

15、P-2主要是能促進(jìn)OB前體細(xì)胞向成熟OB轉(zhuǎn)化，而且可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞系中OPG的表達(dá)。DO的成骨過程和骨折愈合有相似之處。Tamiyo K4-644-51等人用原位雜交方法在對(duì)鼠骨折后骨折愈合過程中OPG表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，在骨折第1天和軟骨形成的第7天OPG表達(dá)明顯增高，而第1天表達(dá)最高，第3天迅速下降，第7天又增高，后又逐漸下降，第28天僅有微弱表達(dá)，而在DO中OPG表達(dá)的研究相對(duì)較少。國(guó)內(nèi)祝為橋在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，大鼠下頜骨牽引后牽引區(qū)新骨的OPG和RANKL在牽引早期表達(dá)明顯，隨時(shí)間的推移表達(dá)逐漸下降。以上研究提示OPG可能在骨折愈合和DO早期促進(jìn)牽引區(qū)新骨生成扮演重要作用，為OPG在骨折愈合和

16、DO的研究奠定了基礎(chǔ)。在本研究中我們采用免疫組化方法觀察到，在穩(wěn)定期的不同時(shí)期，牽引區(qū)新骨生成處的OB和骨髓SC中均存在OPG的表達(dá)。在穩(wěn)定期第1、3天，主要表達(dá)在增殖活躍的成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞等骨髓基質(zhì)細(xì)胞中，在穩(wěn)定期第7天；主要表達(dá)于沿牽引方向排列的成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中；在穩(wěn)定期第14天，主要表達(dá)在排列于骨小梁周圍的OB中，而在成熟的骨細(xì)胞中表達(dá)較少。 牽引成骨是一個(gè)復(fù)雜而特殊的骨再生過程，本實(shí)驗(yàn)通過兔下頜DO動(dòng)物模型研究，結(jié)果顯示局部應(yīng)用外源性rhBMP-2可以促進(jìn)牽引區(qū)新骨生成，具有加快新骨生成和鈣化的作用，但具有劑量依賴性。從而為縮短DO療程和減少并發(fā)癥提供了一種可能的途徑，為治療

17、一些骨科疾病打下理論基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Min H，Morony S，Sarosi I，et al.Osteoprotegerin reverses osteoporosis by inhibiting endosteal osteoclasts and prevents vascular calcification by blocking a process resembling osteoclastogenesisJ.J Exp Med，2000，192：463-474.2Kanzaki H，Chiba M，Shimizu Y，et al.periodontal ligament cel

18、ls under mechanical stress regulation via rostaglandin E2 synthesisJ.J Bone MIner Res，2002，17(2):210-220.3Oshiro at，shiotani A，shibasaki Y，et al.Permental movement of incisirs in osteoprotegerin-deficient miceJ.Anat Rec 2002，266(4)：218-225.4Hasegawa T，Kikuiri T，Takeyama S，et al.Human periodontal ligament cells derived from decidous teeth induce osteoclastogenesis in vitro J.Tissue Cell，2002，34(1)：44-51.5Hofbauer LC，Dunstan CR，Spelsberg TC，et al.osteoprotegerin production by human osteoblast lineage cells in stimulated by bitamin D，bone morpho