肺炎克雷伯氏菌的藥敏試驗

1、深圳動物園15株肺炎克雷伯氏菌耐藥性的檢測動物醫(yī)學(xué)院 動物醫(yī)學(xué) 唐春成（指導(dǎo)老師：楊光友 教 授）摘要：目的：了解深圳動物園黑猩猩等10種靈長動物肺炎克雷伯氏菌的耐藥特性及趨勢，指導(dǎo)臨床合理用藥。方法：用K-B紙片擴散法做藥物敏感試驗。結(jié)果：檢測的15株肺炎克雷伯氏菌對21種抗生素的藥敏結(jié)果顯示，對萘啶酸、氨芐西林、羧芐西林和四環(huán)素的耐藥率最高，均為100%；其次為磺胺甲基異惡唑、頭孢唑啉（先鋒霉素V）、多西環(huán)素和多粘菌素B，其耐藥率分別是93.33%、87.78%、80%和80%；對環(huán)丙沙星、阿奇霉素、諾氟沙星、頭孢呋新、加替沙星、奈替米星和磷霉素的耐藥率分別是73.33%、73.33%、6

2、0%、60%、53.33%、53.33%和53.33%；對頭孢西林和呋喃妥因的耐藥率均為40%；對頭孢噻肟、亞胺硫霉素和阿米卡星的耐藥率分別為33.33%、26.67%和20% ；菌株對拉氧頭孢鈉的耐藥率為0 。結(jié)論：該地區(qū)肺炎克雷伯氏菌所引起的疾病治療的首選藥氧頭孢烯類，其次可合理選用第三代頭孢菌素、氨基糖甙類、碳青霉烯類、呋喃類藥。關(guān)鍵詞：肺炎克雷伯氏菌；耐藥性；檢測Resistance testing of 15 bahts Klebsiella Pneumoniae in Shenzhen zooTang Chuncheng Veterinary，Grade2006 Directed

3、by Yang Guangyou（professor）Abstract：Objective: To understand the Shenzhen Zoo chimpanzees and other 9 primates Klebsiella pneumoniaes resistance characteristics and trends to guide clinical use of drugs. Method: K-B disk diffusion method to do drug susceptibility testing. Results: The detection of 1

4、5 bahts Klebsiella pneumoniae to 21 antibiotics showed that the resistance rate of Nalidixic acid, Ampicillin, Carbenicillin and Tetracycline are the highest are 100%；This was followed by SMZ-TMP, cefazolin (Vanguard ADM V), doxycycline, polymyxin B, that drug resistance rate was 93.33%,87.78%,80%,8

5、0%; to ciprofloxacin, azithromycin , norfloxacin, cefuroxime, gatifloxacin, netilmicin, fosfomycin the resistance rate was 73.33%,73.33%,60%,60%,53.33%,53.33% and 53.33%;Resistance rates of xilin of cephalosporins, nitrofurantoin were 40%; And resistance rates right cefotaxime, imipenem, amikacin we

6、re 33.33%, 26.67%, 20%; Fortunately,0 is the resistance rate of strain to Latamoxef sodium. Conclusion: The Klebsiella pneumoniae in diseases caused by treatment of first choice for drug oxacephems, followed by the selection of the third generation can be reasonably cephalosporins, aminoglycosides,

7、carbapenems, furan, amide alcohols medicine.Key words: Klebsiella pneumoniae; resistance; detect 肺炎克雷伯氏菌屬于革蘭氏陰性腸桿菌科(Enterobacteraceae)克雷伯菌屬(klebsiella)。 本菌為兼性厭氧菌，無鞭毛，無動力。有較厚的莢膜,多數(shù)菌株有菌毛。營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長的菌落大，呈粘液狀，互融合，以接種環(huán)挑之易拉成絲，此特征有助于鑒別。37生長最佳，但能在15-45及pH5.5-10范圍內(nèi)生長發(fā)育，最適pH為7.0-7.6, pH在5以下和11以上不能生長，50以

8、上既被滅活。本屬具有O和K兩種抗原。K抗原可用于菌型鑒定。O抗原耐熱，10002.5小時加熱仍不能破壞其O不凝聚性。因而給本菌的O抗原鑒定和研究帶來很多困難?？死撞暇鷮佻F(xiàn)有82個英膜型，肺炎亞種大多屬于3型和12型1。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella Pneumoniae)廣泛分布于自然界，是人和動物腸道、呼吸道的條件致病菌2，于1893年由Friediander首先從患大葉性肺炎病人的肺組織中分離到，當機體免疫力降低或長期大量使用抗生素導(dǎo)致菌群失調(diào)時引起感染，可引起肺炎、敗血癥、腦膜炎、肝膿腫、眼內(nèi)炎、泌尿系統(tǒng)發(fā)炎，或是傷口感染等，若治療不當則死亡率極高。在糖尿病患者合并肝膿腫的致病菌

9、株分析中發(fā)現(xiàn)，在人類感染中目前是除大腸桿菌外的醫(yī)源性感染最重要的條件致病菌。在動物中各種家畜家禽、野生動物及水生動物都可感染，其中野生動物主要包括金絲猴等靈長類動物。近年來由于-內(nèi)酰胺類藥物廣泛應(yīng)用，革蘭氏陰性桿菌對氨芐西林、頭孢一代抗生素耐藥率逐年上升，頭孢唑啉抗菌活性優(yōu)于氨芐西林，頭抱唑啉平均耐藥率為13.8，而氨芐西林高達94.9，不宜作為治療肺炎克雷伯氏菌感染的首選用藥，這是由于這些耐藥菌株產(chǎn)生IM-1、TM-2、SHY-l等廣譜-內(nèi)酰胺酶的緣故3。氨基糖苷類抗生素中阿米卡星抗菌活性優(yōu)于慶大霉素及鏈霉紊。阿米卡星平均耐藥率為13.4。而慶大霉索、鏈霉素分別為26.2、35.9。臨床菌株

10、中對氨基糖苷類產(chǎn)生耐藥性的主要機制為修飾酶產(chǎn)生，且3-磷酸轉(zhuǎn)移酶最多見4。磺胺類中復(fù)方新諾明平均耐藥率達489，不宜作為治療肺炎克雷伯氏菌感染的首選用藥5。臨床菌株對磺胺類產(chǎn)生耐藥性的主要機制是細菌能自身合成葉酸6。近年來的研究已證明，肺炎克雷伯氏菌的耐藥性可由染色體介導(dǎo)或質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生，其耐藥機制與下列3個方面有關(guān)：細菌外膜的屏障作用；作用靶位結(jié)構(gòu)的改變；水解酶的產(chǎn)生7-9。由于肺炎克雷伯氏菌能產(chǎn)超光譜-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）10，以及抗生素的不合理使用導(dǎo)致耐藥現(xiàn)象嚴重。為了了解深圳動物園肺炎克雷伯氏菌的耐藥特性及趨勢，指導(dǎo)臨床合理用藥。本實驗將對該動物園黑猩猩等10種靈長動物消化道分泌物中分

11、離出的肺炎克雷伯氏菌進行耐藥性的研究，從而在靈長類動物臨床上對該菌感染的用藥有一定的指導(dǎo)意義，并可減少細菌耐藥的產(chǎn)生。1 材料與方法1.1 實驗材料1.1.1 菌株來源 自2009年4月從深圳動物園黑猩猩等10種靈長類動物呼吸道分泌物，由我校寄生蟲病實驗室分離培養(yǎng)鑒定并提供肺炎克雷伯氏菌15株，其編號分別為：SHE-1-1、SHE-2-1、SHE-2-2、SHE-5-1、SHE-6-1、SHE-7-1、SHE-10-1、SHE-10-2、SHE-11-1、SHE-11-2、SHE-16-1、SHE-17-1、SHE-17-2、SHE-18-1、SHE-21-1。1.1.2 抗生素紙片 本實驗所

12、用抗生素紙片均購自杭州微生物試劑有限公司。有如下21種：萘啶酸、諾氟沙星（氟哌酸）、環(huán)丙沙星（丙氟哌酸）、加替沙星、磺胺甲基異惡唑、頭孢唑啉（先鋒霉素V）、頭孢呋新、頭孢西林、頭孢噻肟、羧芐西林、氨芐西林、阿米卡星、奈替米星、四環(huán)素、多西環(huán)素、磷霉素、呋喃妥因、拉氧頭孢鈉、亞胺硫霉素、多粘菌素B、阿奇霉素。1.1.3 主要實驗試劑 蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、檸檬酸鈉、蒸餾水、pH試紙。1.1.4 主要實驗儀器 超凈工作臺、恒溫干燥箱、恒溫箱、超低溫冰箱、電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋。1.2 實驗時間與地點本實驗于2009年6月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)國家級動物類實驗教學(xué)中心進行

13、。1.3 實驗方法與設(shè)計1.3.1 培養(yǎng)基制做 由于該菌可以在普通瓊脂培養(yǎng)基上很好的生長，故只需制做普通瓊脂培養(yǎng)基。步驟如下：按以下劑量稱取各種試劑（先稱取鹽類再稱蛋白胨及牛肉膏），置于2L燒杯中：牛肉膏：5g，蛋白胨:10g，氯化鈉:5g，磷酸氫二鉀:1g，蒸餾水:1000ml；將上述成分混合加熱溶解后，以0.1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整酸堿度至pH7.4-7.6；將pH測定后的肉湯培養(yǎng)基用濾紙濾過；將過濾好的肉湯分裝試管，每管5ml，塞上棉塞，用包裝紙扎好待滅菌；稱取瓊脂10g，加入500ml肉湯中，加熱煮沸，待瓊脂完全融化后，將pH調(diào)至7.4-7.6。再煮沸20分鐘，并注意補充蒸發(fā)的水分

14、，不斷攪拌，不得使其溢出或燒焦；用蒸餾水濕潤夾有薄層脫脂棉的紗布過濾后裝入滅菌鹽水瓶中，包扎好待滅菌；將待滅菌的培養(yǎng)基置高壓蒸氣鍋內(nèi)，12115-30min；將滅好菌的瓊脂肉湯在合適溫度（50-60）時倒入滅菌平皿中10-15ml/個，并使培養(yǎng)基平鋪于皿底，即普通瓊脂平板；將做好的培養(yǎng)基于冰箱內(nèi)4保存。1.3.2 KB法藥物敏感試驗 將21種含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周圍擴散形成遞減的濃度梯度，在紙片周圍濃度范圍內(nèi)測試菌的生長被抑制，從而形成無菌生長的透明圈即為抑菌圈(環(huán))。操作步驟如下：將分離保存好的菌株在營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)

15、，37恒溫箱中培養(yǎng)10h左右，直到營養(yǎng)肉湯渾濁。與菌液比濁管比濁，調(diào)整濁度與比濁管相同；無菌環(huán)境中，將培養(yǎng)好的菌株接種于普通平板中。接種時，取其菌液0.2ml滴加于平板中，并用L型玻棒均勻涂布于平板中；待平板上的水分被瓊脂完全吸收后，用無菌鑷子取抗生素紙片貼在平板表面，紙片一貼就不可再移動。每個平板貼6張紙片，每張紙片間距不少于24mm，紙片中心距平板邊緣不少于15mm。在菌接種后15min內(nèi)貼完紙片，置于37恒溫箱中培養(yǎng)16-18h，觀察并用精確度為1mm的直尺測定抑菌圈直徑。判定標準：由于各種藥物的抑菌圈大小的規(guī)定不同，根據(jù)所測抑菌圈大小來確定菌株對各種藥物的敏感性。R為耐藥，I為中敏，S

16、為敏感（表1）。表1 肺炎克雷伯氏菌耐藥判定標準Table 1 The standard of Klebsiella Pneumoniae resistance to determine 藥物名稱抑菌圈直徑（mm）藥物名稱簡寫藥物含藥量ug/片RIS萘啶酸1314-1819NAL30諾氟沙星（氟哌酸）1213-1516NFX10環(huán)丙沙星（丙氟哌酸）1516-2021CIP5加替沙星1415-17185磺胺甲基異惡唑1011-1516SMZ-TMP300頭孢唑啉（先鋒霉素V）1415-1718CZ30頭孢呋新1415-1718CEF30頭孢西林1415-1718CFX30頭孢噻肟1415-222

17、3CTX30羧芐西林1920-2223100氨芐西林1314-1617AMP10阿米卡星1415-1617AMI30奈替米星1213-1415NTL30四環(huán)素1112-1415TE30多西環(huán)素1011-1314DOC30磷霉素1213-1516FOM200呋喃妥因1415-1617NFT300拉氧頭孢鈉1415-222330亞胺硫霉素1314-1516IPM10多粘菌素B1112300IU阿奇霉素1314-2223152 結(jié)果與分析2.1 受檢的15株肺炎克雷伯氏菌對21種抗生素的藥敏結(jié)果顯示：對萘啶酸、氨芐西林、羧芐西林、四環(huán)素的耐藥率最高，均為100%：其次為磺胺甲基異惡唑、頭孢唑啉（先鋒

18、霉素V）、多西環(huán)素、多粘菌素B，耐藥率分別是93.33%、87.78%、80%、80%；對環(huán)丙沙星、阿奇霉素、諾氟沙星、頭孢呋新、加替沙星、奈替米星、磷霉素的耐藥率分別是73.33%、73.33%、60%、60%、53.33%、53.33%、53.33%；對頭孢西林和呋喃妥因的耐藥率均為40%；對頭孢噻肟、亞胺硫霉素、阿米卡星的耐藥率分別為33.33%、26.67%、20% ；菌株對拉氧頭孢鈉的耐藥率為0（表2和圖1）。表2 15株菌株對21種抗生素的耐藥率Table 2 resistance rates of 15 strains to 21 antibiotics 抗菌藥物耐藥中介敏感萘啶

19、酸15（100%）00氨芐西林15（100%）00羧芐西林15（100%）00四環(huán)素15（100%）00磺胺甲基異惡唑14（93.33%）1（6.67%）0頭孢唑啉（先鋒霉素V）13（86.67%）2（13.33%）0多西環(huán)素12（80%）2（13.33%）1（6.67%）多粘菌素B12（80%）03（20%）環(huán)丙沙星11（73.33%）4（26.67%）0阿奇霉素11（73.33%）3（20%）1（6.67%）諾氟沙星9（60%）1（6.67%）5（33.33%）頭孢呋新9（60%）3（20%）3（20%）加替沙星8（53.33%）3（20%）4（26.67%）奈替米星8（53.33%）3（

20、20%）4（26.67%）磷霉素8（53.33%）4（26.67%）3（20%）頭孢西林6（40%）2（13.33%）7（46.67%）呋喃妥因6（40%）5（33.33%）4（26.67%）頭孢噻肟5（33.33%）8（53.33%）2（13.33%）亞胺硫霉素4（26.67%）3（20%）8（53.33%）阿米卡星3（20%）3（20%）9（60%）拉氧頭孢鈉011（73.33%）4（26.67%）圖1 15株菌株對21種抗生素的耐藥率Figure 1 resistance rates of 15 strains to 21 antibiotics2.2 本實驗數(shù)據(jù)還顯示出本地區(qū)肺炎克雷伯

21、氏菌出現(xiàn)了嚴重的多重耐藥現(xiàn)象：SHE-1-1耐藥14種、SHE-2-1耐藥16種、SHE-2-2耐藥14種、SHE-5-1耐藥11種、SHE-6-1耐藥14種、SHE-7-1耐藥17種、SHE-10-1耐藥16種、SHE-10-2耐藥15種、SHE-11-1耐藥12種、SHE-11-2耐藥13種、SHE-16-1耐藥12種、SHE-17-1耐藥12種、SHE-17-2耐藥10種、SHE-18-1耐藥13種、SHE-21-1耐藥11種（表3）。 表3 15株菌株的多重耐藥情況Table 2 Multi-drug resistance of 15 strains 菌株編號耐藥種數(shù)（種）SHE-1-

22、114SHE-2-116SHE-2-214SHE-5-111SHE-6-114SHE-7-117SHE-10-116SHE-10-215SHE-11-112SHE-11-213SHE-16-112SHE-17-112SHE-17-210SHE-18-113SHE-21-1113 結(jié)論與討論 本研究藥敏結(jié)果顯示本地區(qū)肺炎克雷伯氏菌對多種臨床常用抗菌藥物出現(xiàn)較高耐藥率，且交叉耐藥嚴重。本實驗對肺炎克雷伯氏菌耐藥機制進行了一定探討。其耐藥機制可能有下面幾種：產(chǎn)生相應(yīng)的滅活酶，滅活抗生素；改變靶位蛋白，降低靶蛋白與抗生素親和力，或產(chǎn)生一種新的靶蛋白，使抗生素不能與其結(jié)合，不能發(fā)揮殺菌作用；改變細菌外膜

23、通透性，減少抗生素進入菌體內(nèi)或使其不能進入菌體，使抗生素?zé)o法發(fā)揮抗菌作用；增強外流(efflux)，通過菌體內(nèi)流出泵系統(tǒng)(effluxpump system)將進入菌體內(nèi)的抗生素泵出菌體外，使抗生素不能在菌體內(nèi)積聚發(fā)揮作用11，主動外排機制是近年來研究較多的一個耐藥機制，是細菌對抗生素耐藥的另一個重要途徑，在能量的支持下，外排泵系統(tǒng)可以將進入細胞的藥物選擇或非選擇性地排出；當細菌內(nèi)某種調(diào)節(jié)機制發(fā)生改變，導(dǎo)致外排系統(tǒng)表達亢進，使細菌體內(nèi)的藥物濃度降低而出現(xiàn)耐藥；生物膜的形成12。此外一些細菌的耐藥質(zhì)粒可在細菌間相互傳播。故加強肺炎克雷伯氏菌分離株的耐藥監(jiān)測，分析總結(jié)其耐藥規(guī)律和特點，有助于指導(dǎo)臨

24、床合理應(yīng)用抗菌藥物。3.1 肺炎克雷伯桿菌總體耐藥情況 本實驗檢測了15株肺炎克雷伯氏菌，表2結(jié)果顯示肺炎克雷伯氏菌對對萘啶酸、氨芐西林、羧芐西林、四環(huán)素的耐藥率最高，均為100%：其次為磺胺甲基異惡唑、頭孢唑啉（先鋒霉素V）、多西環(huán)素、多粘菌素B，耐藥率分別是93.33%、87.78%、80%、80%；對環(huán)丙沙星、阿奇霉素、諾氟沙星、頭孢呋新、加替沙星、奈替米星、磷霉素的耐藥率分別是73.33%、73.33%、60%、60%、53.33%、53.33%、53.33%；對頭孢西林和呋喃妥因的耐藥率均為40%；對頭孢噻肟、亞胺硫霉素、阿米卡星的耐藥率分別為33.33%、26.67%、20%。本實

25、驗結(jié)果提示肺炎克雷伯氏菌不僅對青霉素類、第一代頭孢菌素、四環(huán)素、磺胺類等傳統(tǒng)抗菌藥物耐藥，而且對近年來臨床選用頻率較高的氟喹諾酮類、第三代頭孢菌素、酶抑制劑、氨基糖甙類、大環(huán)內(nèi)酯類以及多肽類等也有較高的耐藥性。這可能與本地區(qū)臨床長期大量使用此類藥物有關(guān)，因此應(yīng)嚴格掌握抗生素應(yīng)用指征，以減輕抗菌藥物的選擇性壓力。對碳青霉烯類耐藥率稍低，原因可能為碳青霉烯類藥物具有獨特的分子結(jié)構(gòu)，而且該地區(qū)較少使用此類藥物，細菌與其接觸機會少有關(guān)。而對氧頭孢烯還未產(chǎn)生耐藥，分析其原因可能為：對細菌外膜有良好穿透作用；幾乎對所有的-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定；與靶位蛋白有較強的親和力，特別是青霉素結(jié)合蛋白；臨床應(yīng)用少使細菌與其接

26、觸機會小，藥物誘導(dǎo)耐藥性的發(fā)生率低13。如今大多數(shù)細菌一對絕大部分抗菌藥物產(chǎn)生了較高耐藥性，需引起醫(yī)學(xué)工作者的重視。盡早進行細菌的分離培養(yǎng)和藥敏實驗，指導(dǎo)臨床合理用藥，具有臨床治療和藥物經(jīng)濟學(xué)的積極意義。3.2 肺炎克雷伯菌氏多重耐藥情況 本實驗中可見一株細菌同時對多種抗生素耐藥現(xiàn)象，原因可能有以下幾點：細菌的質(zhì)粒上常常攜帶著對多種抗菌藥物耐藥的基因，且這種耐藥基因可在種或?qū)匍g轉(zhuǎn)移14；在這些細菌中一株細菌可同時產(chǎn)生幾種ESBLs，同時產(chǎn)ESBLs細菌對抗菌藥物作用靶位的改變及對抗生素通透性的改變，使產(chǎn)ESBLs細菌主動排出抗菌藥物，且產(chǎn)ESBLs細菌缺乏自溶酶，而導(dǎo)致多重耐藥15。對一些高危

27、因素地區(qū)進行有目的監(jiān)測，轉(zhuǎn)移感染動物進行隔離等，均可有效控制耐藥性產(chǎn)生及流行。3.3 結(jié)論 對所試21種抗菌藥物除拉氧頭孢鈉外，其它20種抗菌藥物均有耐藥菌株出現(xiàn)。經(jīng)檢測，本實驗中15株菌對萘啶酸、氨芐西林、羧芐西林、四環(huán)素、磺胺甲基異惡唑的耐藥率達到90以上，對環(huán)丙沙星、阿奇霉素、諾氟沙星、頭孢呋新、加替沙星、奈替米星、磷霉素、孢西林、呋喃妥因>40，故本地區(qū)此類藥物要慎用；應(yīng)合理使用頭孢噻肟、亞胺硫霉素、阿米卡星等耐藥性稍低的藥物；對氧頭孢烯類藥物耐藥率最低，可將氧頭孢烯類藥物作為該菌菌引起的嚴重感染的首選藥物。參考文獻：1 賈艷，韓文瑜,楊洋,等.肺炎克雷伯氏菌致病機制研究進展.第

28、六屆理事會第二次會議暨教學(xué)專業(yè)委員會論文集,20062 陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)（第四版）M.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2007：118-1203 徐雪松，孫景春,李秀,等.肺炎克雷伯菌的耐藥性與脈沖凝膠電泳分型J.中華醫(yī)學(xué)檢驗雜志，1999,22(1)：40-434 張軍民，吳堅，陣民構(gòu)，等.包氏不動桿菌5年耐藥性監(jiān)測結(jié)果分析M.中華醫(yī)學(xué)檢驗雜志，1999,22(1)：53-55 5 戴自英.臨床抗菌藥物學(xué)M.北京：人民衛(wèi)生出版杜,1985:86-876 尉挺,徐立傲現(xiàn)代藥物治療學(xué)M北京：人民軍醫(yī)出版社，1995:26-327 Nkaido H, Vaara M. Molecular of bactorial outer membrence permeability.Micmbiolrer,1985,49:1 8 Jomesz A. Penicillin binding proteins end the a