醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品的后處理工程

1、醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品的后處理工程第一節(jié)第一節(jié) 細(xì)胞破碎與固液分離細(xì)胞破碎與固液分離 細(xì)胞壁由堅固的多聚糖，乙酰葡萄糖胺和乙酰胞壁酸形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)，有一定的阻力，針對這種結(jié)構(gòu)，細(xì)胞破碎方法分為機(jī)械和非機(jī)械兩種方法。機(jī)械破碎法機(jī)械破碎法高速勻漿法(High Pressure homogenizer)高速珠磨法(High-speed bead mill)超聲破碎法(Ultrosonication)高壓擠壓法: 本方法是用特殊裝置X-Press擠壓機(jī).非機(jī)械破碎法非機(jī)械破碎法酶溶法酶溶法(Enzymatic Lysis): 常用的溶酶有溶菌酶(Lysozyme), 葡聚糖酶(Glucanase),

2、 蛋白酶(Protease), 糖苷酶(Glycosidase), 甘露糖酶(Mannanase), 肽鍵內(nèi)切酶(Endopeptidase), 殼多糖酶(chitinase)等。2. 化學(xué)滲透法（化學(xué)滲透法（Chemical Permeation）: 這種方法的優(yōu)點是：a. 對目的產(chǎn)物的釋出有一定的選擇性； 細(xì)胞外形保持完整，碎片少，有利于進(jìn)一步分離純化； 分子量大的核酸釋出少，漿液黏度低，有利于提?。黄淙秉c是： 操作時間長，效率低，一般胞內(nèi)目的產(chǎn)物釋放率不超過 50%，而處理時間在2小時以上，因此為了防止活性損失往往需要加添還原劑（巰基乙醇）進(jìn)行保護(hù)；b. 有些化學(xué)試劑本身有毒性，進(jìn)一步分

3、離純化時需通過透析等 方法除去所有試劑。固液分離固液分離離心沉淀: 離心是固液分離的主要手段,其中包括高速離心和超速離心.過濾: 過濾包括粗濾(布、金屬網(wǎng)、纖維濾器等)和膜過濾。第二節(jié)第二節(jié) 目的產(chǎn)物的分離純化目的產(chǎn)物的分離純化 目前分離純化最好的方法是色譜和電泳，但是受各種因素的限制，電泳遠(yuǎn)不能用于醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品的規(guī)模生產(chǎn)上，因此色譜成為人們研究的重點。另外，雙水相萃取也是前期分離常用的方法。雙水相萃取雙水相萃取 雙水相系統(tǒng)由兩種水溶高聚物如聚乙二醇葡聚糖(PEG-Destran)或一種高聚物與無機(jī)鹽在水溶液中混合而成。因兩相均含有較多的水,所以稱之為雙水相。常用的雙水相系統(tǒng)為PEG-De

4、stran和無機(jī)鹽。由于Destran價格高，因此PEG-無機(jī)鹽應(yīng)用更為廣泛。 與色譜分析相比。 雙水相萃取所能達(dá)到的純度還相差較遠(yuǎn)。二二. 色譜技術(shù)色譜技術(shù) 色譜技術(shù)是醫(yī)藥生物技術(shù)下游過程精制階段的常用手段。其優(yōu)點是具有多種分離機(jī)制、設(shè)備簡單、便于自動化控制以及分離過程中無發(fā)熱等有害效應(yīng)。 色譜技術(shù)可分為分析色譜（10mg) 、半制備色譜（1050mg）、制備色譜（100mg10g）和工業(yè)性生產(chǎn)色譜（20g/d）。 在傳統(tǒng)的色譜技術(shù)基礎(chǔ)上，七十年代以來，發(fā)展起來的高效液相色譜（High Perfomance Liquid Chromatography HPLC）引人注目。HPLC的分離原理和

5、常規(guī)色譜技術(shù)相似，它的特點是具有專有的高壓輸液系統(tǒng)、靈敏的檢測設(shè)備和高效分離柱，其優(yōu)點是分離效率高、選擇性好，適用于各種多組分混合物的分離，它的應(yīng)用范圍幾乎包括了所有的物質(zhì)類型，從天然產(chǎn)物到合成產(chǎn)物，從小分子物質(zhì)到大分子物質(zhì)，從一般化合物到生物活性物等。HPLC既是精細(xì)的分離純化方法。也是快速靈敏、準(zhǔn)確、簡便的分析檢測手段。 體積排阻色譜 (Size Exclusion Chromatography, SEC) SEC一般能分離的分子量范圍為1200萬；平均粒度為313。2. 離子交換色譜離子交換色譜 (Ion Exchange Chromatography, IEC) 離子交換色譜的基本原理

6、是通過帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進(jìn)行交換而達(dá)到分離。 對生物大分子進(jìn)行分離純化可采用兩種方式： （1）. 是將目的產(chǎn)物離子化，被交換到介質(zhì)上，而雜質(zhì)不被吸附，從柱中流出，稱之為“正吸附”其優(yōu)點是目的產(chǎn)物純度高，而且可達(dá)到濃縮目的。 （2）. 另一種方式是將雜質(zhì)離子化后被交換，而且目的產(chǎn)物不被交換直接流出，這種方式稱之為“負(fù)吸附”。采用這種方法可除去50%70%的雜質(zhì)，適用于目的產(chǎn)物濃度較高的工作溶液。 反相色譜 (Reversed Phase Chromatography, RPC) : RPC是基于溶質(zhì)，極性流動性和非極性固定相表面間的疏水效應(yīng)建立的一種色譜方式。4. 疏水作用

7、色譜 (Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC) HIC的原理與PCR相似，區(qū)別是HIC填料表面的疏水性沒有RPC強(qiáng)，可用填料有有機(jī)聚合物(交聯(lián)瓊脂糖 Sepharose12，乙烯聚合物等)和大孔硅膠鍵合相兩類。 親和色譜（Affinity Chromatography, AC） AC是利用生物大分子特異的親和力而建立的層析技術(shù)。親和分析的過程大致分為三步：a. 配基固定化，選擇合適的配基與不溶性支撐載體偶聯(lián)或共價結(jié)合成具有特異親和性的分離介質(zhì)；b. 吸附目的物，親和層析介質(zhì)選擇性吸附目的蛋白，而雜質(zhì)與層析介質(zhì)間沒有親和作用，不被吸附，可經(jīng)洗滌去

8、除；c. 樣品解析：選擇合適的條件，將吸附在親和介質(zhì)上的目的物解析下來?？贵w親和層析的步驟是：a. 用純化的目的基因蛋白質(zhì)產(chǎn)品免疫動物，獲得 抗體；b. 把抗體置于親和層析柱上，然后使基因工程制 備的含有多種雜蛋白的混合液，通過層析柱， 具有目的基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物可與柱上的抗體發(fā) 生親和結(jié)合；c. 洗脫柱上蛋白質(zhì)，可以得到高度純化的產(chǎn)物。電泳分離技術(shù)電泳分離技術(shù) 電泳技術(shù)分離純化的基本原理是：蛋白質(zhì)或多肽分子是含有可帶正電荷的氨基、亞氨基、酰胺基等和可帶負(fù)電的羧基、苯酚基、巰基等的兩性生物大分子，帶有正電荷的蛋白質(zhì)分子在電場作用下向陰極方向移動，而帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)分子向陽極方向移動。 平板電泳：

9、 平板電泳分為水平平板電泳和垂直平板電泳種方式。2. 連續(xù)凝膠電泳： 連續(xù)凝膠電泳實質(zhì)上是垂直聚丙烯酰胺凝膠平板電泳的發(fā)展，實現(xiàn)了在同批次連續(xù)把各個電泳區(qū)帶分離回收，并可進(jìn)行多批次的分離操作。 等點聚焦電泳: 含有多氨基，多羧基的一系列聚合物混合形成的兩性電解質(zhì)，在電場作用下，可以形成一個從陽極到陰極PH值逐漸增加的PH梯度。當(dāng)不同的蛋白質(zhì)處在這種環(huán)境時，處于比其等電點低的PH環(huán)境中的蛋白質(zhì)會帶正電荷，向陰極方向移動，反之向陽極方向移動，在移動的過程中隨著環(huán)境PH的改變，逐步達(dá)到與其等電點相同的PH環(huán)境中，這是其所帶電荷為零在電場不再移動而形成區(qū)帶，從而達(dá)到不同蛋白質(zhì)分離的目的。4. 連續(xù)流動

10、電泳： 連續(xù)流動電泳是在紙電泳的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，以濾紙為載體，將欲分離的樣品以固定方式不斷加在濾紙上（加陽點位置根據(jù)組分的電泳行為確定）。在電場作用下帶不同電荷的組分隨電泳緩沖液向前流動的同時，向不同電極方向移動，在濾紙表面形成不同的拋物線狀的遷移軌跡，在濾紙末端剪成鋸齒狀，分別接收流出的各個組分，達(dá)到分離末端物的目的。 無載體連續(xù)流動電泳: 這種電泳的原理是，含蛋白質(zhì)的溶液沿平板表面流動，形成液膜，在液膜兩側(cè)加上電極，隨著液膜向前流動的同時，又向電極方向遷移，形成拋物線軌跡，使它們彼此分開，分別收集即可達(dá)到分離的目的.表表1. 某些生物大分子的分離和純化某些生物大分子的分離和純化表2 幾種

11、檢測目的物純度方法的比較第三節(jié)第三節(jié) 目的產(chǎn)物的質(zhì)量檢控目的產(chǎn)物的質(zhì)量檢控純度分析純度分析 常用的純度檢測方法有: PAGE、SDS-PAGE、毛細(xì)管電泳（CE）、等電聚焦（IEF）、HPLC等，也可用一些化學(xué)方法，如觀察末端是否均一等。氨基酸分析氨基酸分析 氨基酸分析可以用自動分析儀進(jìn)行，氨基酸分析可分為柱后反應(yīng)法和柱前反應(yīng)法兩類。重組蛋白質(zhì)的濃度測定和分子量測定重組蛋白質(zhì)的濃度測定和分子量測定 蛋白質(zhì)的濃度測定；紫外法比較方便，又不損耗蛋白質(zhì)樣品。在未知摩爾消光系數(shù)的情況下，可以簡單地測定280nm和260nm光吸收值，然后用公式計算： 蛋白質(zhì)濃度 用考馬斯藍(lán)G-250測蛋白質(zhì)濃度時，是在

12、酸性條件下使試劑與蛋白質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)，其特征吸收率由465nm轉(zhuǎn)移到595nm ，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)595nm的吸光度與蛋白質(zhì)濃度成線形關(guān)系，因此可作為定量依據(jù)。 凝膠過濾法是測定蛋白質(zhì)分子量的最常用的方法，已廣泛使用的是Sephadex系列（G-75，G-100等）和HPLC凝膠過濾系統(tǒng)。SDS-PAGE是實驗室測定蛋白質(zhì)分子量的常規(guī)方法。四四. 肽譜分析肽譜分析 肽譜分析是用酶解或化學(xué)降解（溴化氰法等）目的蛋白質(zhì)后對生成的肽段進(jìn)行的分解分析，它也是檢測目的產(chǎn)物的指標(biāo)之一。 蛋白質(zhì)的二硫鍵分析蛋白質(zhì)的二硫鍵分析 二硫鍵和巰基與蛋白質(zhì)的生物活性密切相關(guān)，測定巰基的方法有PMCB法、DTNB法和

13、NEMI法等?；蚬こ棠康漠a(chǎn)物的硫-硫鍵是否正確配對，是一個重要問題，例如IL-2分子中有Cys-58和Cys-105形成的硫-硫鍵，而Cys-125是以游離巰基形式存在，如果發(fā)生錯誤配對，不但生物活性只有原來的1/400而且會形成抗原性。為此用蛋白質(zhì)工程法將IL-2的Cys-125改為Ser或Ala，使其生物活性和熱穩(wěn)定性得以改善。目的物的生物活性測定目的物的生物活性測定 體外生物活性測定方法有靶細(xì)胞培養(yǎng)計數(shù)法、3H-TaR摻入法和酶法細(xì)胞計數(shù)等。體內(nèi)生物活性測定要根據(jù)目的產(chǎn)物的生物學(xué)特性建立適合的生物學(xué)模型。第四節(jié)第四節(jié) 目的產(chǎn)物的保存目的產(chǎn)物的保存液態(tài)保存液態(tài)保存低溫保存: 液態(tài)蛋白質(zhì)樣品在-1020以下冷凍保存比較理想。2. 在穩(wěn)定PH條件下保存： 蛋白質(zhì)較穩(wěn)定的PH一般在等電點。保存液態(tài)蛋白質(zhì)樣品時，應(yīng)小心調(diào)整到其穩(wěn)定的PH范圍內(nèi)。3. 在高濃度下保存： 一般蛋白質(zhì)在濃溶液中比較穩(wěn)定。4. 在保護(hù)