污染物評(píng)定方法bylhc

1、食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 致癌實(shí)驗(yàn)致癌實(shí)驗(yàn) 劉海超劉海超2012013255GB15193范圍 本標(biāo)準(zhǔn)適用于評(píng)價(jià)食品生產(chǎn)、加工、保藏、運(yùn)輸和銷(xiāo)售過(guò)程中所涉及的可能對(duì)健康造成危害的化學(xué)、生物和物理因素的致癌作用，檢驗(yàn)對(duì)象包括食品及其原料、食品添加劑、新資源食品、輻照食品、食品相關(guān)產(chǎn)品（用于食品的包裝材料、容器、洗滌劑消毒劑和用于食品生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)的工具、設(shè)備）以及食品污染物等。術(shù)語(yǔ)和定義致癌性：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物長(zhǎng)期重復(fù)給予受試物所引起的腫瘤（良性和惡性）病變發(fā)生。靶器官：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)由受試物引起明顯毒性作用的器官。最大耐受劑量：是由90天經(jīng)口毒性試驗(yàn)確定的劑量，此劑量應(yīng)使動(dòng)物體重減輕不超過(guò)對(duì)照組的10

2、，并且不產(chǎn)生由非腫瘤因素引起死亡及導(dǎo)致縮短壽命的中毒體征或病理?yè)p傷。目的、儀器和試劑試驗(yàn)?zāi)康模捍_定在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的大部分生命期間，經(jīng)口重復(fù)給予受試物引起的致癌效應(yīng)，了解腫瘤發(fā)生率、靶器官、腫瘤性質(zhì)、腫瘤發(fā)生時(shí)間和每只動(dòng)物腫瘤發(fā)生數(shù)，為預(yù)測(cè)人群接觸該受試物的致癌作用以及最終評(píng)定該受試物能否應(yīng)用于食品提供依據(jù)。儀器與器械：實(shí)驗(yàn)室常用解剖器械、動(dòng)物天平、電子天平、生物顯微鏡、生化分析儀、血細(xì)胞分析儀、血液凝固分析儀、尿液分析儀、離心機(jī)、切片機(jī)等。試劑：甲醛、二甲苯、乙醇、蘇木素、伊紅、石蠟、血球稀釋液、生化試劑、血凝分析試劑、尿分析試劑等。實(shí)驗(yàn)方法1.受試物受試物應(yīng)使用原始樣品，若不能使用原始樣品，應(yīng)按

3、照受試物處理原則對(duì)受試物進(jìn)行適當(dāng)處理。將受試物摻入飼料、飲用水或灌胃給予。受試物制備或存放時(shí)，要求不影響飼料的營(yíng)養(yǎng)成分含量和性質(zhì)。2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（1）.選擇腫瘤自發(fā)率低的動(dòng)物種屬和品系，可選用大鼠、小鼠，周齡6周8周。試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)每個(gè)性別動(dòng)物體重差異不應(yīng)超過(guò)平均體重的20%。每組動(dòng)物數(shù)至少100只，雌雄各半，雌鼠應(yīng)為非經(jīng)產(chǎn)鼠、非孕鼠。若計(jì)劃試驗(yàn)中期剖檢，應(yīng)增加動(dòng)物數(shù)（每組至少20只，雌雄各半）。對(duì)照組動(dòng)物性別和數(shù)量應(yīng)與受試物組相同。（2）.試驗(yàn)前動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房至少應(yīng)進(jìn)行3日5日環(huán)境適應(yīng)和檢疫觀(guān)察。（3）.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)條件、飲用水、飼料應(yīng)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和有關(guān)規(guī)定。試驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲水和攝食，推薦單籠

4、飼養(yǎng)，亦可按組分性別分籠群飼，每籠動(dòng)物數(shù)（一般大鼠不超過(guò)3只，小鼠不超過(guò)5只）應(yīng)滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)動(dòng)物最低需要的空間，以不影響動(dòng)物自由活動(dòng)和觀(guān)察動(dòng)物的體征為宜。試驗(yàn)期間每組動(dòng)物非試驗(yàn)因素死亡率應(yīng)小于10%，瀕死動(dòng)物應(yīng)盡可能進(jìn)行血液生化指標(biāo)檢測(cè)、大體解剖以及病理組織學(xué)檢查，每組生物標(biāo)本損失率應(yīng)小于10%。實(shí)驗(yàn)方法3.劑量及分組（1）.試驗(yàn)至少設(shè)3個(gè)受試物組，1個(gè)陰性（溶媒）對(duì)照組，對(duì)照組除不給予受試物外，其余處理均同受試物組。必要時(shí)增設(shè)未處理對(duì)照組。（2）.高劑量應(yīng)選擇最大耐受劑量，原則上應(yīng)使動(dòng)物出現(xiàn)比較明顯的毒性反應(yīng)，但不引起過(guò)高死亡率；低劑量不引起任何毒性效應(yīng)；中劑量應(yīng)介于高劑量與低劑量之間，可引起輕

5、度的毒性效應(yīng)。一般劑量的組間距以2倍4倍為宜，不超過(guò)10倍。4.受試物給予（1）.根據(jù)受試物的特性和試驗(yàn)?zāi)康?，選擇受試物摻入飼料、飲水或灌胃方式給予。若受試物影響動(dòng)物適口性，應(yīng)灌胃給予。（2）.受試物灌胃給予，要將受試物溶解或懸浮于合適的溶媒中，首選溶媒為水，不溶于水的受試物可使用植物油（如橄欖油、玉米油等），不溶于水或油的受試物可使用羧甲基纖維素、淀粉等配成混懸液或糊狀物等。受試物應(yīng)新鮮配制，有資料表明其溶液或混懸液儲(chǔ)存穩(wěn)定者除外。同時(shí)應(yīng)考慮使用的溶媒可能對(duì)受試物被機(jī)體吸收、分布、代謝和蓄積的影響；對(duì)受試物理化性質(zhì)的影響及由此而引起的毒性特征的影響；對(duì)動(dòng)物攝食量或飲水量或營(yíng)養(yǎng)狀況的影響。實(shí)驗(yàn)

6、方法為保證受試物在動(dòng)物體內(nèi)濃度的穩(wěn)定性，每日同一時(shí)段灌胃1次（每周灌胃6天），試驗(yàn)期間，前4周每周稱(chēng)體重2次，第5周13周每周稱(chēng)體重1次，之后每4周稱(chēng)體重1次，按體重調(diào)整灌胃體積。灌胃體積一般不超過(guò)10 mL/kg BW，如為水溶液時(shí)，最大灌胃體積可達(dá)20 mL/kg BW；如為油性液體，灌胃體積應(yīng)不超過(guò)4 mL/kg BW。各組灌胃體積一致。（3）.受試物摻入飼料或飲水給予，要將受試物與飼料（或飲水）充分混勻并保證該受試物配制的穩(wěn)定性和均一性，以不影響動(dòng)物攝食、營(yíng)養(yǎng)平衡和飲水量為原則。飼料中加入受試物的量很少時(shí)，宜先將受試物加入少量飼料中充分混勻后，再加入一定量飼料后再混勻，如此反復(fù)3次4次

7、。受試物摻入飼料比例一般小于質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，若超過(guò)5%時(shí)（最大不應(yīng)超過(guò)10%），可調(diào)整對(duì)照組飼料營(yíng)養(yǎng)素水平（若受試物無(wú)熱量或營(yíng)養(yǎng)成分，且添加比例大于5時(shí)，對(duì)照組飼料應(yīng)填充甲基纖維素等，摻入量等同高劑量），使其與受試物各劑量組飼料營(yíng)養(yǎng)素水平保持一致，同時(shí)增設(shè)未處理對(duì)照組；亦可視受試物熱量或營(yíng)養(yǎng)成份的狀況調(diào)整劑量組飼料營(yíng)養(yǎng)素水平，使其與對(duì)照組飼料營(yíng)養(yǎng)素水平保持一致。受試物劑量單位是每公斤體重所攝入受試物的毫克（或克）數(shù)，即mg/kg BW（或g/kg BW），當(dāng)受試物摻入飼料其劑量單位亦可表示為mg/kg（或g/kg)飼料，摻入飲水則表示為mg/mL水。受試物摻入飼料時(shí)，需將受試物劑量（mg/kg

8、BW）按動(dòng)物每100克體重的攝食量折算為受試物飼料濃度（mg/kg飼料）。實(shí)驗(yàn)方法 入飲水則表示為mg/mL水。受試物摻入飼料時(shí)，需將受試物劑量（mg/kg BW）按動(dòng)物每100克體重的攝食量折算為受試物飼料濃度（mg/kg飼料）。5.試驗(yàn)期限（1）.小鼠為18個(gè)月，大鼠為24個(gè)月，個(gè)別生命期較長(zhǎng)和自發(fā)性腫瘤率較低的動(dòng)物可適當(dāng)延長(zhǎng)。（2）. 試驗(yàn)期間，當(dāng)最低劑量組或?qū)φ战M存活的動(dòng)物數(shù)僅為開(kāi)始時(shí)的25%時(shí)（雌、雄性動(dòng)物分別計(jì)算），可及時(shí)終止試驗(yàn)。高劑量組動(dòng)物因明顯的受試物毒性作用出現(xiàn)早期死亡，不應(yīng)終止試驗(yàn)。6.試驗(yàn)步驟和觀(guān)察指標(biāo)（1）.一般觀(guān)察 試驗(yàn)期間至少每天觀(guān)察一次動(dòng)物的一般臨床表現(xiàn)，并記錄

9、動(dòng)物出現(xiàn)中毒的體征、程度和持續(xù)時(shí)間及死亡情況。 應(yīng)特別注意腫瘤的發(fā)生，記錄腫瘤發(fā)生時(shí)間、發(fā)生部位、大小、形狀和發(fā)展等情況。 對(duì)瀕死和死亡動(dòng)物應(yīng)及時(shí)解剖并盡量準(zhǔn)確記錄死亡時(shí)間。實(shí)驗(yàn)方法（2）.體重、攝食量及飲水量 試驗(yàn)期間前13周每周記錄動(dòng)物體重、攝食量或飲水量（當(dāng)受試物經(jīng)飲水給予時(shí)），之后每4周一次。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，計(jì)算動(dòng)物體重增長(zhǎng)量、總攝食量、食物利用率（前三個(gè)月）、受試物總攝入量。（3）.眼部檢查 試驗(yàn)前，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行眼部檢查（角膜、球結(jié)膜、虹膜）。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)高劑量組和對(duì)照組動(dòng)物進(jìn)行眼部檢查，若發(fā)現(xiàn)高劑量組動(dòng)物有眼部變化，則應(yīng)對(duì)其他組動(dòng)物進(jìn)行檢查。（4）.血液學(xué)檢查 試驗(yàn)第3、6、12個(gè)月進(jìn)

10、行血液學(xué)檢查，必要時(shí)，試驗(yàn)第18個(gè)月和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)也可進(jìn)行，每組至少檢查雌雄各10只動(dòng)物，每次檢查應(yīng)盡可能使用同一動(dòng)物。如果90天經(jīng)口毒性試驗(yàn)的劑量水平相當(dāng)且未見(jiàn)任何血液學(xué)指標(biāo)改變，則試驗(yàn)第3個(gè)月可不檢查。 檢查指標(biāo)為白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)（至少三分類(lèi)）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞平均容（MCV）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白量（MCH）、紅細(xì)胞平均血紅蛋蛋白、凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）等。如果對(duì)造血系統(tǒng)有影響，應(yīng)加測(cè)網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和骨髓涂片細(xì)胞學(xué)檢查。 試驗(yàn)方法（5）.血生化檢查 按規(guī)定的時(shí)間和動(dòng)物數(shù)進(jìn)行。如果90天經(jīng)口毒性試驗(yàn)的劑量水平相當(dāng)且未見(jiàn)任何

11、血生化指標(biāo)改變，則試驗(yàn)第3個(gè)月可不檢查。采血前宜將動(dòng)物禁食過(guò)夜。 檢查指標(biāo)包括電解質(zhì)平衡、糖、脂和蛋白質(zhì)代謝、肝（細(xì)胞、膽管）腎功能等方面。至少包含谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（AKP）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、尿素（Urea）、肌酐（Cr）、血糖（Glu）、總蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、鈣、氯、鉀、鈉、總膽紅素等，必要時(shí)可檢測(cè)磷、尿酸（UA）、總膽汁酸（TBA）、球蛋白、膽堿酯酶、山梨醇脫氫酶、高鐵血紅蛋白、激素等指標(biāo)。（6）.尿液檢查 試驗(yàn)前、試驗(yàn)第3、6、12個(gè)月進(jìn)行尿液檢查，必要時(shí)，試驗(yàn)第18個(gè)月及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)也可進(jìn)行，每

12、組至少檢查雌雄各10只動(dòng)物。如果90天經(jīng)口毒性試驗(yàn)的劑量水平相當(dāng)且未見(jiàn)任何尿液檢查結(jié)果異常，則試驗(yàn)第3個(gè)月可不檢查。實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法神經(jīng)、脊髓（頸、胸和腰段）、腎上腺、甲狀旁腺、甲狀腺、胸腺、氣管、肺、主動(dòng)脈、心臟、骨髓、淋巴結(jié)、脾臟、腎臟、膀胱、前列腺、睪丸、附睪、子宮、卵巢、乳腺等。必要時(shí)可加測(cè)精囊腺和凝固腺、副淚腺、任氏腺、鼻甲、子宮頸、輸卵管、陰道、骨、肌肉、皮膚和眼球等組織器官。應(yīng)有組織病理學(xué)檢查報(bào)告，病變組織給出病理組織學(xué)照片。數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評(píng)價(jià)6.數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評(píng)價(jià)（1）.數(shù)據(jù)處理 應(yīng)將所有的數(shù)據(jù)和結(jié)果以表格形式進(jìn)行總結(jié)，列出各組試驗(yàn)開(kāi)始前的動(dòng)物數(shù)、試驗(yàn)期間動(dòng)物死亡數(shù)及死亡時(shí)間、

13、出現(xiàn)腫瘤及其他毒性反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)，重點(diǎn)描述腫瘤發(fā)生部位、數(shù)量、性質(zhì)、癌前病變及腫瘤潛伏期。 腫瘤發(fā)生率是整個(gè)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)患腫瘤動(dòng)物數(shù)在有效動(dòng)物總數(shù)中所占的百分率。 有效動(dòng)物總數(shù)指最早發(fā)現(xiàn)腫瘤時(shí)存活動(dòng)物總數(shù)。 腫瘤發(fā)生率（%）=（試驗(yàn)結(jié)束時(shí)患腫瘤動(dòng)物數(shù)/有效動(dòng)物總數(shù)）100%腫瘤潛伏期即從攝入受試物起到發(fā)現(xiàn)腫瘤的時(shí)間，因?yàn)閮?nèi)臟腫瘤不易覺(jué)察，通常將腫瘤引起該動(dòng)物死亡的時(shí)間定為發(fā)生腫瘤的時(shí)間。 對(duì)動(dòng)物體重、攝食量、飲水量（受試物經(jīng)飲水給予）、食物利用率、血液學(xué)指標(biāo)、血生化指標(biāo)、尿液檢查指標(biāo)、臟器重量、臟/體比和臟/腦比、大體和組織病理學(xué)檢查、患腫瘤的動(dòng)物數(shù)、每只動(dòng)物腫瘤發(fā)生數(shù)、各種腫瘤（良性和惡性）的數(shù)量、腫瘤發(fā)生率及腫瘤潛伏期等結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。一般情況，計(jì)量資料采用方差分析，進(jìn)行受試物各劑量組與對(duì)照組之間均數(shù)比較，分類(lèi)資料采用Fisher精確分布檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用Ridit分析、秩和檢驗(yàn)等。數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評(píng)價(jià)2.結(jié)果評(píng)價(jià) 致癌試驗(yàn)陰性結(jié)果確立的前提是小鼠在試驗(yàn)期為15個(gè)月或大鼠為18個(gè)月時(shí)，各組動(dòng)物存活率不小于50；小鼠在試驗(yàn)期為18個(gè)月