滋養(yǎng)層細(xì)胞的制備

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上1器材眼科鑷子；眼科剪；平皿；200目篩；小燒杯；細(xì)胞計數(shù)板；離心管2試劑雙抗；DMEM(DMEM/F12)；FBS；胰蛋白酶(0.25%)；-膠原酶(0.1%)；PBS；75%酒精；0.4%臺盼藍(lán)；3方法步驟3.1滋養(yǎng)層的分離(1) 將剝離下的組織放入75%酒精中10s，用含雙抗的PBS沖洗 2次，取出組織放入含有雙抗的 PBS緩沖液中，4保存，6-8 小時內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。(2) 將采集的胎盤樣品用75%的酒精表面消毒后迅速的移入到新鮮的含雙抗的PBS緩沖液中沖洗2-3次，移入無菌間內(nèi)的超凈工作臺內(nèi)。無菌雙抗 PBS緩沖液沖洗 3 次，用眼科剪小心剝離胎膜、尿囊膜、毛

2、細(xì)血管等與絨毛膜緊密相連組織，無菌雙抗PBS緩沖液沖洗3次。(3)用眼科剪剪成 1-3mm3的組織小塊，含雙抗的PBS懸浮沉淀漂洗 3 次，每次 3 min。加入等體積于組織樣品的 0. 25 %胰蛋白酶消化液，37恒溫震蕩箱消化 10 min，棄上清。再加入等樣品 20-30 倍的 0.25%胰蛋白酶和 0. 1 %膠原酶 1:1 復(fù)合消化液，37消化 30 min，收集上清液。將剩余組織再次加入復(fù)合消化液 5 min，直至大部分組織被消化成細(xì)胞懸液，收集每次消化后的上清液加入等體積含10%血清的培養(yǎng)基終止消化。(4) 將所得到的細(xì)胞懸液通過200 目的不銹鋼篩網(wǎng)。(5) 1200 r/mi

3、n,離心5 min,用完全培養(yǎng)基重懸離心沉淀的細(xì)胞,將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至56X105個/mL。(6)置于37 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；隔日更換培養(yǎng)基一次以去除血細(xì)胞和其它無法貼壁的成分，待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液，此后每 3d 更換培養(yǎng)液 1 次。直至首次傳代。3.2滋養(yǎng)層的純化與傳代純化過程與傳代培養(yǎng)同時進(jìn)行。當(dāng)原代培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細(xì)胞貼壁生長到 90%以上匯合度時應(yīng)進(jìn)行傳代。首次傳代前 24 小時更換培養(yǎng)液。(1)反復(fù)貼壁法將原代培養(yǎng)的細(xì)胞用 0. 25%胰蛋白酶消化后，制成不含血清的細(xì)胞懸液，接種到培養(yǎng)瓶內(nèi)，靜止 20 min；鏡下觀察部分細(xì)胞貼壁（稍加搖蕩也不浮起），由于在無血清培養(yǎng)液內(nèi)成纖

4、維細(xì)胞比上皮細(xì)胞貼壁快，此時的貼壁細(xì)胞主要為成纖維細(xì)胞，上皮細(xì)胞大多數(shù)懸浮在培養(yǎng)液內(nèi)，然后將培養(yǎng)液（含未貼壁細(xì)胞）吸到另一培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入含血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；再次制備不含血清的細(xì)胞懸液，重復(fù)以上操作傳代培養(yǎng) 3 次，可獲得較高濃度的胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞。(2)消化排除法將原代培養(yǎng)的細(xì)胞用 0. 25%胰蛋白酶消化液（含 0. 02% EDTA）加入培養(yǎng)的細(xì)胞中，鏡下見纖維樣細(xì)胞縮短變圓，部分細(xì)胞脫壁，立即加入含有血清的培養(yǎng)液終止消化。輕輕振搖培養(yǎng)瓶后，倒掉液體，用含血清的培養(yǎng)液清洗瓶內(nèi)貼壁的細(xì)胞，最后向瓶內(nèi)加入含血清的培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)，等下次傳代時重復(fù)以上操作。這樣重復(fù)傳代 5 次即可得到純度較高

5、的胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞。（因成纖維細(xì)胞比上皮來的滋養(yǎng)層細(xì)胞先脫落，將先消化下的成纖維細(xì)胞棄掉，這樣經(jīng)過幾次反復(fù)傳代處理，可把成纖維細(xì)胞除凈）。用胰蛋白酶消化細(xì)胞要嚴(yán)格控制消化時間，此過程始終保持在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)滋養(yǎng)層細(xì)胞生長區(qū)域內(nèi)有細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞質(zhì)回縮現(xiàn)象時終止消化。棄掉消化液，在室溫下靜置 1 min 左右，加入適量的培養(yǎng)液，用移液槍輕輕吹打成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為 1X106個細(xì)胞/mL，按 1：3 的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。3.3細(xì)胞活力檢測(臺盼藍(lán)排斥試驗(yàn))通過消化法分離組織，制備成單細(xì)胞懸液，做適當(dāng)稀釋（106/ml）)后取 9滴細(xì)胞懸液移入小試管中，加 1 滴 0.4%臺盼藍(lán)溶液，混勻，

6、鏡下觀察，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染，在 3 分鐘內(nèi)用血球計數(shù)板分別計數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)，并計算細(xì)胞活率，重復(fù) 6 次取平均值。根據(jù)下列公式計算細(xì)胞活力：活細(xì)胞率(%)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%3.4細(xì)胞凍存試驗(yàn)(1)培養(yǎng)的細(xì)胞匯合達(dá)80%左右時,可進(jìn)行細(xì)胞凍存,傾斜培養(yǎng)瓶,吸去陳舊培養(yǎng)基,37°C預(yù)熱的PBS洗3次。(2)使用37°C預(yù)熱的濃度為0.25%胰蛋白酶,使液體覆蓋整個瓶底面,盡快移至37 °C培養(yǎng)箱內(nèi),大部分細(xì)胞消化脫離瓶壁即可。(3)使用等量的含有血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基,使胰蛋白酶停止消化作用,防止對細(xì)

7、胞的過度消化,輕輕吹打使細(xì)胞,使細(xì)胞以單個形式存在。(4)移液器將消化得到細(xì)胞懸液,置于準(zhǔn)備好的15mL離心管,細(xì)胞保持混勻狀態(tài),微量移液器吸取少量細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)試驗(yàn),其余細(xì)胞液體則用來進(jìn)行細(xì)胞凍存。(5)細(xì)胞懸液離心,1500 r/min,10 min,盡可能去除上清液體,保持細(xì)胞團(tuán)塊的完整性。(6)現(xiàn)用現(xiàn)配細(xì)胞凍存液(DMEM:FBS : DMSO = 7: 2: 1),加入一定量的細(xì)胞凍存液重新懸浮細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度。(7)-80過夜保存,投入液氮,進(jìn)行長期保存。3.5滋養(yǎng)層細(xì)胞的復(fù)蘇試驗(yàn)(1)把標(biāo)記好的細(xì)胞凍存管,立即放入37的水浴鍋內(nèi)解凍,期間不停地溫和搖動,使凍存液快速融化。(2)凍存管使用75%的酒精消毒后,在超凈臺內(nèi),細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入15mL的離心管。(3)再加入15mL的高糖DMEM完全培養(yǎng)基,移液器輕輕吹打細(xì)胞懸液混合均勻,離心,1200 r/min,10 min,倒掉細(xì)胞上清液,剰余的是細(xì)胞團(tuán)塊。(4)使用3mL的高糖DMEM重新懸浮