實(shí)時熒光定量PCR20160520

1、劉亭劉亭2016.05.252016.05.25內(nèi)容內(nèi)容常規(guī)常規(guī)PCRPCR：擴(kuò)增：擴(kuò)增DNADNA，借助電泳對擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析，借助電泳對擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析變性變性退火退火延伸延伸Y0 2 4 8 16 Y0 2n擴(kuò)增擴(kuò)增DNADNA，利用熒光信號的變化實(shí)時檢測，利用熒光信號的變化實(shí)時檢測PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最終精確的對起始模板的定量分析循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最終精確的對起始模板的定量分析Y0 2 4 8 16 Y0 2n擴(kuò)增曲線背景期對數(shù)增長期線性增長期平臺期 熒光嵌合熒光嵌合法（法（非特異性）非特異性）S

2、YBR Green SYBR Green I I 熒光探針熒光探針法（法（特異性特異性）TaqMan probeTaqMan probeCycling probeCycling probeReal Time Real Time PCR PCR 的熒光的熒光化學(xué)檢測化學(xué)檢測原理原理非特異性的熒光嵌合法非特異性的熒光嵌合法 SYBR Green ISYBR Green I SYBR Green ISYBR Green I是一種能夠結(jié)合于所有雙鏈?zhǔn)且环N能夠結(jié)合于所有雙鏈DNADNA小溝中的熒光染料，小溝中的熒光染料，SYBRSYBR與與PCRPCR合成合成DNADNA雙鏈結(jié)雙鏈結(jié)合后，發(fā)射熒光信號，

3、而游離的合后，發(fā)射熒光信號，而游離的 SYBR SYBR 不會發(fā)射熒光信號，因此熒光信號的增加與不會發(fā)射熒光信號，因此熒光信號的增加與PCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物的增加完全的增加完全同步同步優(yōu)點(diǎn)：簡單易行，成本優(yōu)點(diǎn)：簡單易行，成本較低較低缺點(diǎn)：與缺點(diǎn)：與非特異性產(chǎn)物結(jié)合非特異性產(chǎn)物結(jié)合，不能進(jìn)行多重，不能進(jìn)行多重PCRPCR適用：不同樣本同一基因適用：不同樣本同一基因相對表達(dá)量分析相對表達(dá)量分析特異性熒光探針法特異性熒光探針法 TaqMan TaqMan probe probe Taqman 探針是一段與目的基因配對的DNA序列，5端加熒光物質(zhì)，3端加淬滅物質(zhì)，完整探針5端的熒光物質(zhì)被3端淬滅物質(zhì)抑制

4、，不發(fā)熒光，當(dāng)PCR合成DNA，退火時探針和DNA配對，延伸時，由于DNA聚合酶也有核酸外切酶活性，將探針分解， 5端熒光物質(zhì)游離出來，發(fā)出熒光，檢測熒光強(qiáng)度，表征PCR擴(kuò)增的DNA量。優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，能進(jìn)行多重優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，能進(jìn)行多重PCRPCR缺點(diǎn)：需設(shè)計特異性探針，成本較高缺點(diǎn)：需設(shè)計特異性探針，成本較高適用：區(qū)別同源性高的序列，適用：區(qū)別同源性高的序列，SNPSNP解析等多重解析等多重PCRPCR檢測檢測閾值（ Threshold ）：在擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期設(shè)定的熒光檢出界限（第315個循環(huán)的熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍）C(t)值（Cycle of threshold）：熒光信號（擴(kuò)增產(chǎn)

5、物）到達(dá)閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)閾值C(tC(t) )值值 18.12 +/- 0.0418.12 +/- 0.0418.12 +/- 0.04C(tC(t) )值值18.12 +/- 0.04Real Time Real Time PCR PCR 的數(shù)學(xué)定量的數(shù)學(xué)定量原理原理絕對定量相對定量Real Time Real Time PCR PCR 的數(shù)學(xué)定量的數(shù)學(xué)定量原理原理初始DNA量越多，越早達(dá)到閾值，擴(kuò)增曲線越早起峰，Ct值越小經(jīng)數(shù)學(xué)理論證明，初始DNA量的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)/Ct呈反比線性關(guān)系腫瘤正常絕對絕對定量定量將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，進(jìn)行Real Time PCR,會得到一

6、系列等間隔的擴(kuò)增曲線。以它們的Ct值作橫坐標(biāo)，初始DNA量的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知濃度的樣品進(jìn)行Real Time PCR,得到Ct值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以樣品的初始DNA量。10410310610510210熒光強(qiáng)度-循環(huán)數(shù)曲線初始DNA量對數(shù)-Ct循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線絕對定量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線確定初始DNA/RNA基因拷貝數(shù)或濃度，通常用于病毒，病原菌的定量檢測即轉(zhuǎn)基因食品食品的檢測。相對相對定量定量比較不同樣本之間基因表達(dá)量的高低變化，需要做相對定量。相對定量引入內(nèi)參基因，即維持細(xì)胞基本代謝活動所必需的基因，其表達(dá)量在不同的細(xì)胞里基本一樣，在擴(kuò)增目的基因的同時擴(kuò)增內(nèi)參基因，用不同樣本的

7、目的基因的擴(kuò)增量與各自內(nèi)參基因的擴(kuò)增量的比值對目的基因表達(dá)量進(jìn)行均一化后，再比較高低，可以對不同樣本間細(xì)胞起始數(shù)，RNA提取效率，基因擴(kuò)增效率的不同進(jìn)行矯正。定性分析定性分析: :病毒和病原菌檢測;單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測;物種鑒定定量分析定量分析: :絕對定量:病毒和病原菌定量;基因拷貝數(shù)分析;轉(zhuǎn)基因定量分析相對定量:基因表達(dá)基因表達(dá)量分析量分析基因表達(dá)的中心法則基因表達(dá)的中心法則SYBR green 1 的相對定量法：一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計，材料處理，取材凍存二、目的和內(nèi)參基因的選擇及引物設(shè)計三、準(zhǔn)備試劑與耗材，預(yù)約儀器四、RNA提取，質(zhì)量與濃度檢測，反轉(zhuǎn)錄成cDNA五、按反應(yīng)體系準(zhǔn)備樣品六、上

8、機(jī)設(shè)定反應(yīng)條件，運(yùn)行程序進(jìn)行反應(yīng)七、溶解曲線分析熒光信號產(chǎn)生的特異性八、獲得數(shù)據(jù)，計算分析結(jié)果并做圖對照組Control處理組Drug112h重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)30h3h6h12h重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)33h6h一一 實(shí)驗(yàn)設(shè)計實(shí)驗(yàn)設(shè)計，材料處理，取材凍，材料處理，取材凍存（存（-80-80）對照組對照組處理組處理組0h#1#2#33h#4#5#6#7#8#96h#10#11#12#13#14#1512h#16#17#18#19#20#21二二 目的和內(nèi)參基因的選擇及引物設(shè)計目的和內(nèi)參基因的選擇及引物設(shè)計目的基因的選擇：目的基因的選擇：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膬?nèi)參基因的選擇：內(nèi)參基因的選擇：維持細(xì)胞基本代謝活動所必

9、需的基因，如GAPDH，Actin，18S rRNA等通過查文獻(xiàn)或?qū)嶒?yàn)篩選引物設(shè)計注意事項：引物設(shè)計注意事項：引物設(shè)計軟件 Oligo 7 三三、準(zhǔn)備試劑、準(zhǔn)備試劑，耗材，預(yù)約儀器，耗材，預(yù)約儀器試劑：RNA提取試劑盒，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（21次反應(yīng)），SYBR mix（ 212次反應(yīng)）等耗材：槍頭，EP管等（無RNase處理），96/384孔版，透明薄膜，冰及冰盒等儀器：槍，離心機(jī)，Nanodrop核酸濃度測定儀，核酸電泳儀，熒光定量PCR儀等四、四、RNARNA提取，質(zhì)量與濃度檢測，反轉(zhuǎn)錄成提取，質(zhì)量與濃度檢測，反轉(zhuǎn)錄成cDNAcDNA針對樣品選用一款合適的RNA提取試劑盒取相同量的組織

10、或細(xì)胞提取總RNA提取的總RNA?；煊谢蚪MDNA，可以通過DNase處理去除或跨內(nèi)含子引物設(shè)計避免基因組DNA擴(kuò)增RNA電泳檢測降解情況Nanodrop測定RNA濃度和純度（OD260/2802，OD260/2302）取相同量的RNA（如1ug）做反轉(zhuǎn)錄RNA易降解，而cDNA可于-20保存很久五、按反應(yīng)體系準(zhǔn)備樣品五、按反應(yīng)體系準(zhǔn)備樣品上述cDNA需要進(jìn)行稀釋，稀釋倍數(shù)實(shí)驗(yàn)摸索（使內(nèi)參Ct約20）每個樣品做2個技術(shù)重復(fù)，事先設(shè)計好樣品在96孔板上的排列先把稀釋好的cDNA加到96孔板，再加混好的SYBR mixture,primer,H2O加入96孔板，蓋上透明薄膜，離心后上機(jī)反應(yīng)體系：內(nèi)

11、參42目的42Template cDNA4uL2SYBR mixture10uL420uL420uLForward primer0.5uL21uL21uLReverse primer0.5uL21uL21uLH205uL220uL220uLTotal20uL內(nèi)參目的1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 67 7 8 8 9 9 10 10 11 11 12 1213 13 14 14 15 15 16 16 17 17 18 1819 19 20 20 21 21 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 67 7 8 8 9 9 10 10 11 11 12 1213 13 14 1

12、4 15 15 16 16 17 17 18 1819 19 20 20 21 21 六、上機(jī)設(shè)定反應(yīng)條件，運(yùn)行程序進(jìn)行反應(yīng)六、上機(jī)設(shè)定反應(yīng)條件，運(yùn)行程序進(jìn)行反應(yīng)參考SYBR green 1 Kit 的說明書預(yù)變性：95 ,30s ,20 /s 1 cyclePCR反應(yīng)：95 ,5s ,20 /s 60 ,20s ,20 /s 40 Cycles溶解曲線分析：95 , 0s, 20 /s 72, 15s, 20 /s 95, 0s, 0.3 /s 七七、從溶解曲線確認(rèn)、從溶解曲線確認(rèn)PCRPCR反應(yīng)的反應(yīng)的特異性特異性溶解曲線的一次曲線溶解曲線的負(fù)一次曲線微分曲線PCR反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物呈雙

13、鏈，具有較高的熒光信號強(qiáng)度，此時，將PCR反應(yīng)液的溫度漸漸升高，DNA雙鏈漸漸打開，嵌入DNA雙鏈中的SYBR Green 數(shù)量減少，熒光信號強(qiáng)度漸漸降低，當(dāng)雙鏈DNA解鏈一半時，熒光信號強(qiáng)度急劇下降，此時的溫度即溶解溫度（Tm值），對于某一特定的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其值是固定的。八、八、獲得數(shù)據(jù)，計算分析結(jié)果并做圖獲得數(shù)據(jù)，計算分析結(jié)果并做圖樣品樣品內(nèi)參內(nèi)參Ct目的目的Ct相對表達(dá)量相對表達(dá)量120.15120.12220.13220.14319.88319.99420.45420.21519.45519.70Power(內(nèi)參Ct-目的Ct，2)謝謝關(guān)注，歡迎交流討論！謝謝關(guān)注，歡迎交流討論！常

14、規(guī)常規(guī)PCRPCR：擴(kuò)增：擴(kuò)增DNADNA，借助電泳對擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析，借助電泳對擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析常規(guī)常規(guī)PKPK實(shí)時實(shí)時PCRPCR 實(shí)時熒光定量PCR 常規(guī)PCR能進(jìn)行定量或定性分析靈敏度高，精確度高不需要電泳分析，省時，安全，不易污染需要熒光定量PCR儀，熒光染料等，成本較高只能進(jìn)行半定量或定性分析靈敏度低，精確度低需要電泳分析，費(fèi)時，不安全，易污染只需要普通PCR儀與PCR試劑，成本較低各種熒光檢測方法比較SYBR greentaqmanCycling 優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)適用范圍Real Time Real Time PCRPCR定量定量的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原

15、理理想的理想的PCRPCR反應(yīng)：反應(yīng)：Y Yn n = Y= Y0 02 2n n非理想非理想的的PCRPCR反應(yīng)：反應(yīng)：Y Yn n = Y= Y0 0(1+Ex)(1+Ex)n n方程式兩邊同時取對數(shù)得方程式兩邊同時取對數(shù)得: : logYlogYn n = log= logY Y0 0(1+Ex)(1+Ex)n n整理整理方程式得方程式得: :logYlogY0 0 = =-log(1+Ex)-log(1+Ex)n n + logY + logYn n將將CtCt和和Y YC Ct t帶入帶入上式得：上式得：logYlogY0 0 = =-log(1+Ex)-log(1+Ex)Ct Ct

16、 + logY+ logYCtCtn：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)Yn：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量Y0：初始DNA量Ex：擴(kuò)增效率初始初始DNADNA量量的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)/Ct/Ct呈反比線性關(guān)系呈反比線性關(guān)系定性分析定量分析絕對定量相對定量病毒和病原菌檢測病毒和病原菌檢測單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性/SNP/SNP檢測檢測物種鑒定物種鑒定病毒和病毒和病原菌定量病原菌定量基因拷貝基因拷貝數(shù)分析數(shù)分析轉(zhuǎn)基因定量分析轉(zhuǎn)基因定量分析mRNAmRNA表達(dá)量分析表達(dá)量分析Cycling probeCycling probe利用Cycleave法的SNP解析原理利用Cycleave法的SNP解析原理對照組

17、Control處理組Drug112h重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)30h3h6h12h重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)33h6h0h-1, 0h-2, 0h-3 (1-3)C-3h-1, C-3h-2, C-3h-3 (4-6)C-6h-1, C-6h-2, C-6h-3 (7-9)C-12h-1, C-12h-2, C-12h-3 (10-12)D-3h-1, D-3h-2, D-3h-3 (13-15)D-6h-1, D-6h-2, D-6h-3 (15-18)D-12h-1, D-12h-2, D-12h-3 (19-21)一一 實(shí)驗(yàn)設(shè)計實(shí)驗(yàn)設(shè)計，材料處理，取材凍，材料處理，取材凍存（存（-80-80）標(biāo)準(zhǔn)曲線相對定

18、量法用目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)品分別獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線用目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)品分別獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線處理與未處理樣品同時擴(kuò)增目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因，獲得處理與未處理樣品同時擴(kuò)增目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因，獲得C(t)C(t)值值用內(nèi)標(biāo)基因?qū)δ繕?biāo)基因均一化用內(nèi)標(biāo)基因?qū)δ繕?biāo)基因均一化處理樣本與未處理樣本目標(biāo)基因處理樣本與未處理樣本目標(biāo)基因C(t)C(t)值經(jīng)內(nèi)參基因均一化后相除，即值經(jīng)內(nèi)參基因均一化后相除，即可得出處理樣本與未處理樣本的表達(dá)差異可得出處理樣本與未處理樣本的表達(dá)差異2-c(t) 法公式推導(dǎo)公式推導(dǎo) M:M:目標(biāo)基因，目標(biāo)基因，N N：內(nèi)標(biāo)基因：內(nèi)標(biāo)基因 X XC(t)MC(t)M=X=X0M0M* *2 2C(t)MC(t)M=A(=A(域值域值) (1) (1) X XC(t)NC(t)N=X=X0N0N* *2 2C(t)NC(t)N=A(=A(域值域值) (2) (2) 均一化均一化 (1)/(2):(1)/(2): X X0M0M/X/X0N0