生化分析技術總復習

1、生化分析技術第一編 概述第一章 概論一 生化研究技術：從生物材料中分離、純化生物分子，并對各成分進行檢測的一門科學。二 研究內容：生化分離制備、生化分離分析。三 生化技術特點：1. 材料組成非常復雜2. 目標成分在材料中含量極微3. 生物物質的活性易遭到破壞，需要選擇適宜條件4. 影響因素很多，實驗方法經驗性強第二章 生命大分子物質的制備« 生命大分子：通常指動物、植物和微生物在進行生長發(fā)育、新陳代謝時所形成的蛋白質（包括酶）和核酸等有機化合物的總稱。² 生命大分子物質制備的基本流程：材料的選擇與處理測力方法的確定細胞破碎抽提濃縮純化方案的設計與評價有效成分純度和性質的分析

2、及包裝第一節(jié) 材料的選擇與處理一 材料的選擇« 有效成分：是指欲純化的某種單一的生命大分子物質。« 雜質：有效成分以外的其他物質。² 材料選擇遵循的原則： 有效成分含量多、穩(wěn)定性好 來源豐富、保持新鮮 提取容易、工藝簡單 雜質有綜合利用價值二 材料的處理² 動物臟器：1. 冰凍最常用的處理方法從剛宰殺的動物中得到的臟器，若不馬上抽提、純化時，應及時移至-10冰庫（可短時間保存），或-70低溫冰箱（數月不變質）貯存。2. 干燥制成丙酮粉3. 脫脂方法： 人工剝去臟器外的脂肪組織 浸泡在脂溶性的有機溶劑（如丙酮、乙醚）中脫脂 采用快速加熱（50左右）、快速冷

3、卻的方法，使熔化的油滴冷卻后凝聚成油塊而除去 利用油脂分離器使油脂與水溶液得以分離² 植物組織：若是葉片，需用清水洗凈方可使用，或置-30-4冰箱貯藏，可在10h內使用。若是種子，則需要泡漲或粉碎后才可以使用。（若種子中含油脂較多時，也要進行脫脂處理）² 微生物：若要收集胞外酶或某些輔基，則用接種于適當的培養(yǎng)液培養(yǎng)一段時間后，用離心法收集到的上清液即可。（可置低溫下短時間貯存）若要收集胞內酶，則用收集到的菌體經破碎細胞后提取其有效成分。（可制成凍干粉，在4保存）第二節(jié) 測定方法的確立一 目的與要求1. 目的：跟蹤檢測有效成分。2. 要求：專一、靈敏和簡便快速的測定方法二 常

4、用的測定方法² 光譜法使用最多的一種方法包括：紫外光譜法（測定核酸含量、測定蛋白質的含量及純度）、可見光光譜法、熒光光譜法、濁度法² 電化學法有些化學反應過程放出質子氫（H+），可用靈敏的PH計或NaOH溶液滴定等方法追蹤其變化，從而計算出欲測物的含量或活性。² 生物活性檢測法專一性強但速度慢² 免疫分析法靈敏度高、專一性強采用抗原與抗體之間發(fā)生的特異性反應。² 生物傳感器可通過顯示器反應出有效成分的數量。第三節(jié) 細胞破碎一 機械破碎² 研磨法原理：利用機械作用力用研磨棒研碎，如在研缽中加入一定量的石英砂（4550m）可提高研磨效果。

5、也可用勻漿器處理，此法較溫和，適宜實驗室應用。若是大規(guī)模生產則用電動研磨法。² 組織搗碎器法原理：利用機械作用力這是一種劇烈的破碎細胞的方法。搗碎器（800010000r/min）處理3045s。（動植物細胞皆可，若為酵母或細菌細胞時，需加石英砂才有效。）在搗碎期間，必須保持低溫，以防止操作過程溫度升高引起有效成分變性，搗碎時間也不易太長。² 超聲波法原理：利用超聲波來破碎細胞（20kHz<40kHz）。常用于處理菌體細胞為防止電器長時間運轉產生過多的熱量，常采用間歇處理和降低溫度(冰浴)的方法進行。（噪聲用隔音箱處理）² 凍融法將細胞置低溫下冰凍一定時間后

6、，取出置室溫（或40左右）迅速融化。如此反復凍融多次，細胞可在形成冰粒和增高剩余胞液鹽濃度的同時，發(fā)生溶脹、破碎。² 壓榨法原理：在高壓下使細胞快速通過小孔，并撞擊在撞擊環(huán)上，壓力突然降低的剪切力及撞擊的剪切力使細胞破碎。二 溶脹和自溶(滲透壓沖擊法:是一種較溫和的處理方法)« 溶脹：在低滲溶液如低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子連續(xù)大量進入細胞，引起細胞膜發(fā)生脹破的現象。« 自溶：細胞結構在本身所固有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下，發(fā)生破裂、溶解的現象。三 化學處理用脂溶性的溶劑（如丙酮、氯仿、甲苯）或表面活性劑（如十二烷基磺酸鈉或十二烷基

7、硫酸鈉）處理細胞壁、細胞膜的結構部分溶解，進而使細胞釋放出各種蛋白質類或DNA等物質，并導致整個細胞破碎。四 生物酶降解生物酶（如溶菌酶）有降解細菌細胞壁的功能。第四節(jié) 抽提一. 抽提的含義« 抽提：通常是指用適當的溶液（如緩沖液、稀酸、稀堿或有機溶劑（如丙酮、乙醇）進行反復萃取，逐步將原料中有效成分最大限度分離出來的過程。² 抽提液應具備的條件： 對有效成分溶解度大、破壞作用小 對雜質不溶解或溶解度很小 來源廣泛、價格低廉、操作安全二. 抽提有效成分的影響因子² PH由于生物大分子存在等電點PI，所以，選擇溶液應偏離其PI并穩(wěn)定存在的PH范圍，雜質溶解度最小。抽

8、提堿性蛋白質選用低PH的溶液；抽提酸性蛋白質選用高PH的溶液。² 溶劑的極性會影響大分子物質的溶解度和穩(wěn)定性。降低溶劑極性的方法：在水溶液中加入蔗糖或甘油至一定濃度。增加溶劑極性的方法：加入中性鹽如KCl、NaCl。² 溶液的離子強度會影響不同物質的溶解度。一般來說，離子強度較低的中性鹽溶液有促進蛋白質溶解，保護蛋白質活性的作用，離子強度過高則會引起蛋白質發(fā)生鹽析作用。² 水解酶避免水解的措施：在抽提液中加入抑制劑(苯甲基黃酰氟化物，PMSF)，調節(jié)抽提液的PH、離子濃度、極性等，以使水解酶活性降到最低。² 溫度一般認為蛋白質或酶制品在低溫（0左右）時最

9、穩(wěn)定。² 攪拌攪拌可促使欲抽提物與抽提液之間相互接觸，并能增加溶解度。² 氧化一般蛋白質都含有相當數量的巰基，該基團常常是酶和蛋白質的必需基團。若抽提液中存在氧化劑或氧分子時，會使巰基形成分子內或分子間的二硫鍵導致酶（或蛋白質）失活（或變性）。還原劑：-巰基乙醇（15mmol/L）、半胱氨酸（520mmol/L）、還原谷胱甘肽、巰基乙酸鹽（15mmol/L）、二硫蘇糖醇、抗壞血酸。² 金屬離子蛋白質的巰基除易受氧化劑作用外，還能和金屬離子如鉛、鐵或銅結合，產生沉淀復合物。解決辦法： 用無離子水或重蒸水配置試劑 在配置的試劑中加入13mmol/L EDTA²

10、; 抽提液與抽提物的比例在抽提時，抽提液與抽提物的比例要適當，一般以5:1 為宜。第五節(jié) 濃縮一 沉淀法多用鹽析（較好的方法）。加入適量的中性鹽或有機溶劑，使有效成分變?yōu)槌恋?。鹽析離心分離脫鹽溶解（透析、凝膠過濾）二 吸附法將干葡聚糖凝膠G25（或吸水棒）加入抽提液中，二者比例為1:5。由于凝膠吸水之故，抽提液的體積可縮小3倍左右，回收蛋白質量約80%。三 超過濾法在充氣加壓下使小分子物質（包括水分）通過超濾膜，大分子物質被截留得以濃縮。四 透析法把盛抽提液的透析袋（由半透膜制成）埋在吸水力強的聚乙二醇或甘油中，袋內的水分等小分子物質可透過半透膜逐漸移至袋外，有效成分則留在袋內，抽提液（10m

11、l）可以很快（1h）濃縮到幾乎無水的程度。五 減壓蒸餾法將抽提液裝入減壓蒸餾器的圓底燒瓶中，在減壓真空狀態(tài)下進行蒸餾。六 冰凍干燥法冷凍抽真空水分升華干燥第六節(jié) 純化方案的設計與評價« 純化方案：是指在純化某一物質過程中，根據實際情況將幾種分離方法（如沉淀法、離子交換層系、葡萄糖凝膠等）有機地優(yōu)勢互補、靈活調節(jié)、聯合運作的總稱。一 純化方案的設計對純化方法進行選擇，并使其程序化的過程。原理：根據有效成分和雜質之間的理化性質的差異。原則：一是在純化方案中，切忌一種分離方法重復使用，否則，不但不能提高純化倍數，反而會降低回收率；二是初期設計的提純方案，并非一蹴而就、一成不變，而是在試驗中

12、，往往需要對整個方案及所屬的方法（包括相關細節(jié)）進行不斷地修正、調節(jié)，才能日趨完善。二 純化方案的評價對純化方案的評價，實質上是對組成純化方案的每一種分離方法的評價。比活性=活性單位數/毫克蛋白純化倍數=每步的比活性/粗抽提液的比活性收得率=每步的總活性/粗抽提液總活性×100% 一般收得率<100%，有時會算出>100%原因：純化前有酶抑制劑存在，純化后消除抑制劑，酶活性增高，收得率升高。 也存在酶活力明顯下降的現象。原因：方法不適，純化過程去掉了酶的輔助因子。² 一般符合下列兩點說明此方法具有應用價值：1. 純化倍數>2的方法2. 有一定收得率的方法注

13、：一般純化倍數大，收得率高的方法應用價值大。第七節(jié) 有效成分純度和性質的分析及包裝一 分析常用于鑒定生物制品純度的方法：電泳、免疫分析、薄層層析、薄膜層析常用于檢測其含量和性質的方法：光譜法、氣相層析、生物芯片常用于測定有效成分分子質量的方法:凝膠過濾、電泳常用于測定核酸序列的方法：化學直讀法、酶解直讀法常用于測定蛋白質序列的方法：Edman降解法相結合的薄膜層析二 包裝根據純度不同（成本高低）進行分裝固體裝：克、毫克、微克等液體裝：一般以毫升、微升為單位。第八節(jié) 應用實例Chloroplast isolation Procedure葉綠體分離程序1. Wash 30 gms of spina

14、ch leaves thoroughly first with tap water and then with distill water.將30g菠菜葉先用自來水沖洗，再用蒸餾水洗凈。2. Remove the midrib veins of the leaves and cut into small pieces.取主葉脈兩側的葉片并切成小塊。3. Add 120 ml of 1x Chloroplast Isolation Buffer (CIB) with BSA to the cut leaves in a blender. Blend with 2-3 strokes.在切碎的葉片

15、中加入120mL 1×葉綠體分離緩沖液（CIB）和牛血清白蛋白并一起放入攪拌機中。攪拌2-3下。4. Filter the blended leaves through 6 layers of muslin cloth.用6層棉布過濾混合后的葉片。5. The filtrate is then evenly divided into four 50 ml centrifuge tubes.將濾液均勻分到4個50mL離心管中。6. Centrifuge the tubes for 3 minutes at 200xg. A white pellet will be obtained.在

16、200×g下離心3min。得到一個白色的沉淀。7. Transfer the supernatant into chilled 50 ml centrifuge tubes and centrifuge at 1000×g for 7 minutes. A green pellet will be obtained. 將上清液移至50mL，在1000×g下離心7min。得到一個綠色沉淀。8.Discard the supernatant and break the green pellet gently by finger tapping. 除去上清液，輕輕用手指

17、敲散綠色沉淀。9. Resuspend the pellet in 2ml of 1× CIB buffer with BSA and mix gently by pipetting up and down.將沉淀在2ml 1×CIB緩沖與BSA混合后輕彈。10.Pool the suspended pellet into one centrifuge tube.取沉淀放入離心管。Separation of intact and broken chloroplast分離和破碎完整的葉綠體11.Preparation of 40% Percoll layer: Mi

18、x 4 ml percoll with 6 ml of 1x CIB buffer with BSA.40% Percoll層的制備：將4 ml Percoll和1×CIB緩沖與6mL BSA混合。12.Gently overlay 6ml of the chloroplast suspension over this 40% percoll layer.輕輕地將6毫升葉綠體懸浮液覆蓋在這個40%的Percoll層上。13.Centrifuge at 1700×g for 6 minutes. The intact chloroplast will se

19、diment to the bottom of the tube as a green pellet and the broken chloroplast will form the upper layer.在1700 ×g下離心6 min。綠色顆粒狀的完整的葉綠體會沉積到管底而破碎的葉綠體將在上層。14.Carefully remove the upper layer of the chloroplast suspension leaving only the pellet containing the intact chloroplast.小心地移除葉綠體懸浮液，只留下含有完整顆

20、粒狀的上層葉綠體。15.Mix the pellet with 500 L of 1×CIB buffer without BSA.將完整的葉綠體顆粒與不含BSA的500L 1×CIB的緩沖液混合。第二編 分離技術第三章 離心技術第一節(jié) 基本原理及常用術語一 基本原理：1.定義：離心技術是利用離心機旋轉時產生的強大離心力對大小、形狀和密度不同的混合物進行分離的一種方法。2.描述參數：離心力： 當一個粒子在高速旋轉下受到的離心作用力“Fc”由下式定義： Fc = m·a = m·2 r a：粒子旋轉的加速度， m：沉降粒子的有效質量， ：粒子旋轉的角速度，

21、 r：粒子的旋轉半徑( cm )。 2 r：單位質量的粒子受到的離心力，稱單位離心力，單位離心力用相對離心力來表示。相對離心力：(relative centrifugal foce RCF)：顆粒所受離心力相當于地球重力的倍數 。RCF表示方法：數字×g轉速（N）注意：r平均=（r最小+r最大）/2 一般在低速離心時（轉速小于5000 r/min），離心力的大小常用r/min來表示，而超速離心時則用g或×g來表示。3. 粒子的沉降速度t:沉降時間 :懸浮介質的黏度 rp:顆粒半徑 p:顆粒密度 ：介質密度 rt:旋轉中心到液面的距離 rb:旋轉中心到管底的距離 w：角速度w

22、由公式可知，在一定離心場中，顆粒的沉降速度不僅與離心力有關，而且與顆粒大小、密度以及介質黏度有關。一組不同的顆粒在同一條件下離心時則可以根據它們的密度和顆粒大小而分離。4.沉降系數：顆粒在單位離心力場作用下的沉降速度，用s表示，是為了紀念Svedberg對離心技術的貢獻，單位為S。沉降系數在生物科學中用來表示生物分子或細胞器的大小，如s=2.5×10-12秒，規(guī)定1S=10-13秒，則大小為25S.第二節(jié) 離心機 一 離心機的分類1. 根據其最大轉速可以分為以下幾種：² 普通離心機：最大轉速 6 000r/min， 最大相對離心力6 000×g 型號很多，容量不同

23、，轉速不同，控制不精密用途：固液沉淀分離² 高速離心機：最大轉速 25 000r/min， 最大相對離心力90 000×g 型號較多，轉速不同，有控溫裝置，控制精密（時間、轉速）用途：菌體、細胞碎片、細胞器等的分離² 超速離心機：最大轉速 80 000r/min， 最大相對離心力500 000×g控制精密：時間控制、溫度控制、轉速控制、真空系統(tǒng)用途：細胞器分級分離、病毒、DNA、RNA、蛋白質分離提純等2. 根據轉頭類型可以分為以下幾種：垂直管轉頭3.離心機的正確操作與注意事項 檢查 插好電源：設置離心溫度，使其預冷 平衡：普通離心機差值的最高限度：0.

24、25g，超速離心機：0.1g 放置：對稱 開機設置 計時運轉 停機 取樣第三節(jié) 常用離心技術一 離心方法1.沉淀離心 選定一定的時間、速度進行離心，使樣品液中的大的固型物與液體分離，從而獲得沉淀或上清液。又稱為固液分離法。使用普通離心機。2. 差速離心 在均勻介質中，利用各種物質粒子沉降速度的不同而分批分離的方法。此法一般用于分離沉降系數相差較大的顆粒。這是從細胞勻漿中制備各種亞細胞成分最常用的方法。3.密度梯度離心速率區(qū)帶離心：是根據大小、形狀不同的顆粒在梯度液中沉降速度不同建立起來的分離方法。等密度梯度離心：等密度離心法也叫沉降平衡法。所謂等密度（平衡）是指最終樣品密度與介質的密度相等，實

25、際上是在梯度介質中進行的。速率區(qū)帶離心法等密度梯度離心法原理沉降速度粒子本身的密度平衡介質密度梯度范圍介質密度<樣品密度介質密度>樣品密度時間效應長時間離心，各粒子均沉于管底長時間離心，形成區(qū)帶轉速相對較低高速或超速分離樣品密度差異不大，分子量差異大密度差異大，分子量差異不大² 密度梯度離心后的收集穿刺法：用一根金屬空心針從離心管底刺入管內，不同區(qū)帶內的組分自下而上地先后從針管內分別流出，然后用部分收集器分別收集。取代法：往離心管中注入高密度的離心介質（其密度高于離心管中所形成的最大密度）。當取代液不斷注入時，離心管中的溶液逐漸上升，并不斷從收集導管中流出，然后用部分收集

26、器分別收集。切片法² 密度梯度材料ü 糖類：蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇、右旋糖酐Dextran）、聚蔗糖（Ficoll）、PEG。ü 主要用于細胞、細胞器和病毒的分離ü 鹽類：氯化銫、氯化銣、溴化鉀、碘化鈉、溴化鈉、溴化鋰、溴化銣和檸檬酸鉀等ü 主要用于核酸、蛋白質和病毒的分離純化。ü 有機碘化物 典型的是三碘苯甲酰葡萄糖胺，它是一種優(yōu)良的梯度材料。差速分級離心：只能分離沉降系數相差10倍以上的顆粒。密度梯度離心：用于沉降系數相差10-20%的顆粒，或者顆粒密度差小于0.01%的組分。第三編 純化方法第四章 沉淀法« 沉淀法

27、：是純化生命大分子物質常用的一種經典方法.該法操作簡單、成本低廉，一般包括鹽析沉淀、有機溶劑沉淀和選擇性沉淀等類型。第一節(jié) 基本原理沉淀法也稱溶解度法。其純化生命大分子物質的基本原理是根據各種物質的結構差異（如蛋白質分子表面疏水基團和親水基團之間比例的差異等）來改變溶液的某些性質（如PH、極性、離子強度、金屬離子等），就能使抽提液中有效成分的溶解度發(fā)生變化。第二節(jié) 制備蛋白質鹽析法、有機溶劑沉淀法、蛋白質沉淀法、聚乙二醇沉淀法、選擇性沉淀法、結晶沉淀法一 鹽析法² 鹽析法的根據是：蛋白質在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升（鹽溶），但當鹽濃度增高到一定數值時。其溶解度又逐漸下降

28、，直至蛋白質析出（鹽析）。² 鹽析的發(fā)生在于鹽濃度增高到一定數值時，使水活度降低，進而導致蛋白質分子表面電荷逐漸被中和，水化膜相繼被破壞，最終引起蛋白質分子間相互聚集并從溶液中析出。1. 鹽分及沉淀： 鹽的選擇：一般進行蛋白質沉淀時，常選用的鹽是硫酸銨。² 硫酸銨與其他鹽相比具有的優(yōu)點：ü 溶解度大，對溫度不敏感ü 分級效果好ü 有穩(wěn)定蛋白結構的作用ü 價格低廉、廢液可以肥田鹽分及沉淀的共同缺點：得到的樣品欲繼續(xù)純化時，需要花費一定時間脫鹽。 硫酸銨鹽析：Ø 固體法：在大體積的粗制品溶液中逐步加入固體硫酸銨，當加入到一定飽和

29、度時，蛋白質便可沉淀出來。（通常需攪拌）Ø 飽和溶液法：這是一種使蛋白質脫水沉淀比較溫和的方法。此法對加入固體硫酸銨沉淀法溫和，但是對于大體積樣品不適用，將導致樣品溶液體積增加。Ø 透析法：將盛蛋白質溶液的透析袋放入一定濃度的大體積鹽溶液中，通過透析作用來改變蛋白質溶液中的鹽濃度。適用于較精確、樣品體積小的試驗中使用。2.鹽析曲線制作3.鹽析的影響因子Y 鹽析常數Y 鹽析分級范圍的差異性Y PH和鹽濃度Y 蛋白質的純度和濃度：在混合蛋白質溶液中，不同分子間的相互作用會發(fā)生共沉淀現象。Y 其他：在進行鹽析沉淀時，有時需在溶液中加1mmol/L的EDTA-Na2鹽，以除去沉淀劑

30、中帶入的金屬離子。再者，加硫酸銨沉淀的時間要控制在2h左右，過長過短都不適宜。4.脫鹽常用的脫鹽方法是凝膠過濾法和透析法。二. 有機溶劑沉淀法有機溶劑能降低蛋白質溶解度的原因有二：其一，與鹽溶液一樣具有脫水作用。其二，有機溶劑的介電常數比水小，導致溶劑極性變小。需要注意：低溫下操作、中性鹽作用、多價陽離子作用。² 常用溶劑：甲醇、乙醇、丙酮² 優(yōu)點：有機溶劑沉淀法分辨能力比鹽析法高，沉淀不用脫鹽，過濾比較容易。² 缺點：對某些具有生物活性的大分子，容易引起變性失活，操作常在低溫下進行；分離效果差，共沉作用大；離子強度及離子種類對其也有影響。三 蛋白質沉淀法(特異性

31、強)蛋白質沉淀法所用的試劑僅對一類或一種蛋白質沉淀起作用。1. 堿性蛋白質多價陽離子的堿性蛋白質，如魚精蛋白，能有效地沉淀核酸物質外，還能沉淀某些蛋白質。2. 凝集素是一種特殊的蛋白質，該物質對糖蛋白中糖鏈的末端序列具有明顯、特異的凝集力。該沉淀法的優(yōu)點是反應條件溫和，專一性強。3. 重金屬重金屬鹽（如鉛鹽、汞鹽）作為蛋白質沉淀劑，也能將蛋白質或酶得到純化。由于重金屬會使蛋白質變質，因此應用時要控制在較溫和的條件下進行，并要及時通過透析法把蛋白質與重金屬盡快分開。四 聚乙二醇沉淀法（機理復雜）聚乙二醇（PEG）和右旋糖苷硫酸鈉等用水溶性非離子型聚合物可使蛋白質發(fā)生沉淀作用。這種沉淀的條件溫和，

32、不易引起蛋白質變性，而且沉淀較完全，因此應用范圍頗廣。機理： 可能通過空間位置排斥，使液體中的微粒（包括生物大分子、病毒和細菌等）被迫擠聚在一起而引起沉淀發(fā)生。 與有機溶劑相似，降低水的活度。五 選擇性沉淀法（是一種思路）根據各種蛋白質在不同物理、化學因子（如溫度、酸堿度和有機溶劑等）作用下穩(wěn)定性不同的特點，用選擇性沉淀法，即可使蛋白質變性沉淀，而欲分離的有效成分則存在于溶液中（或者發(fā)生可逆性沉淀），從而達到純化有效成分的目的。六 結晶沉淀法需反復結晶提純：重結晶、復結晶。是分離純化蛋白質、酶等生化產品的一種有效手段。² 結晶沉淀法的影響因素Ø 純度：各種物質在溶液中均需達

33、到一定的純度才能析出結晶，這樣就可以使結晶和母液分開，以達到進一步分離純化的目的。Ø 濃度：結晶液一定要有合適的濃度，結晶的大小、均勻度和結晶的飽和度有很大關系。Ø PH：PH的變化，可以改變溶質分子的帶電性質，是影響溶質分子溶解度的一個重要因素。一般結晶液所選用的PH與沉淀大致相同。Ø 溫度：冷卻的速度及冷卻的溫度直接影響結晶效果。Ø 時間：結晶的形成和生長需要一定時間，不同化合物結晶時間長短不同。Ø 晶種：不易結晶的生化物質常需加晶種，有時用玻璃棒摩擦容器壁也能促進晶體析出。第三節(jié) 制備核酸² 沉淀核酸應注意： 細胞或組織的有效破

34、碎。 盡量保持核酸結構的完整。 有效地使蛋白質復合體變性。 盡量排除其他大分子成分的污染（蛋白質、多糖、及RNA或DNA）。 保證提取的核酸中不含有對酶有抑制作用的有機溶劑及高濃度的金屬離子。一. DNP、RNP的解聚、除蛋白質1.去污劑法：作用：溶解膜蛋白和脂肪。將DNP/RNP復合物解聚、釋放出核酸。操作：DNP/RNP + SDSSDS-蛋白質+DNA（RNA） +乙酸甲PDS-蛋白質+PDS+DNA（RNA） 離心除沉淀 上清=DNA（RNA）2.有機溶劑法：種類：飽和酚、氯仿、酚/氯仿 均為蛋白質變性劑。酚的變性作用強于氯仿。 但由于酚與水一定的互溶：因此酚抽提后可能損失部分核酸，水

35、相中還會殘留酚，而酚的存在會對酶產生強烈的抑制。 由于氯仿可除去酚類，因此操作中可單用氯仿、用酚/氯仿混合液或先用酚作變性劑再用氯仿抽提。3.蛋白水解酶作用：破菌和除去蛋白質同時完成。溫和、可防止破壞核酸分子。用酶解法除去DNP/RNP復合物中的蛋白質組分的操作比較溫和，并可避免剪切和破壞核酸的現象發(fā)生。常用的水解酶有溶菌酶、蛋白酶K和蛋白酶E。注：市售的蛋白酶E中會含有DNase，因此在使用前應采用80處理5min或37溫育0.51.0h的方法，將其失活，而蛋白酶E活性不受影響。二. 多糖等雜質的消除動物材料：宰殺前饑餓12h植物材料：收割前置暗示培養(yǎng)數天?；祀s于核酸提取液的多糖類物質，可用

36、選擇性沉淀劑，如異丙醇、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，適用于酸性多糖）即可達到目的。CTAB/NaCl溶液含10%CTAB，0.7MNaCl有機溶劑沉淀核算時用丙醇和5MNaCl作為沉淀劑，NaCl:用量1/51/2倍體積，異丙醇：0.61.0倍體積。三. DNA與RNA的分離² 鹽析法² 酶水解法：Ø 在提取DNA時，可用RNase水解RNA雜質。有時RNase中會混有DNase，采用100熱處理15min。DNase失活，而RNase活性不受影響。Ø 在提取RNA時，可用DNase水解DNA雜質。有時DNase中會混有RNase，當有鈣離子存在下，

37、加蛋白酶K作用或加碘乙酸鈉（使RNase得活性中心組氨酸殘基烷基化）處理，RNase會失活，而DNase活性不受影響。四. 核酸沉淀有機溶劑（乙醇-鹽溶液、異丙醇）、聚乙二醇、十六烷基胺甲基溴化銨（CTAB）。1. 有機溶劑沉淀法乙醇：優(yōu)點：對鹽類沉淀少，沉淀中所含痕量乙醇易揮發(fā)除去。不影響以后實驗。缺點：需要量大，一般要求低溫操作。異丙醇：優(yōu)點：需體積小，速度快，適于濃度低，體積大的DNA樣品沉淀，一般不需低溫長時間放置。缺點：易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀，異丙醇難以揮發(fā)除去，所以，最后用70%乙醇漂洗數次。注：DNA沉淀中可能會有鹽和其他小分子物質混雜，可用70%乙醇洗滌，除去雜質，真空干

38、燥即為核酸樣品。 復溶：用0.5-1ml TE緩沖液分裝成小體積，-20保存。第五章 層析總論層析方法可根據不同的標準分成若干類型：按流動相分類，有：液相層析和氣相層析。按固定相“床”的類型，有:柱層析、薄板層析、薄膜層析等。第一節(jié) 層析方法的類型名稱原理固定相流動相基質或載體吸附柱層析疏水力和靜電引力固體液體吸附劑：硅膠、氧化鋁、羥基磷灰石、活性炭等薄層層析具體分析固體/液體液體硅膠、氧化鋁、纖維素、交聯葡聚糖等疏水層析疏水力和靜電引力載體和配體液體載體：交聯瓊脂糖 配體：苯基 載體：硅膠、樹脂 配體：苯基、辛基、烷基離子交換層析離子間結合力離子交換劑液體樹脂、葡聚糖凝膠、離子型纖維素分子篩

39、層析排阻效應固體液體交聯瓊脂糖、交聯葡聚糖親和層析親和力聚焦層析電荷效應及離子間的結合力第二節(jié) 常用術語應用實例血清免疫球蛋白G的分離純化及鑒定為了初步掌握蛋白質的分離純化技術，選擇了從家畜血清中分離純化免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，簡稱IgG）的實驗。血清中的蛋白質有數十種之多，IgG是球蛋白的一種。分離純化蛋白質的方法是利用不同蛋白質的某些物理、化學性質（如在一定條件下帶電的情況、分子量、溶解度等）的不同而建立起來的，其中有鹽析、離子交換、凝膠過濾、親和層析、制備電泳和超速離心等。在分離純化時，要根據情況選用幾種方法互相配合才能達到分離純化一種蛋白質的目的。本實驗采用硫酸

40、銨鹽析、DEAE-纖維素離子交換及凝膠過濾等方法，提取家畜血清中IgG。其原理及操作如下：（一）硫酸銨鹽析1.試劑飽和硫酸銨溶液pH7.0：稱?。∟H4）2SO4 760g,加蒸餾水至1000mL，加熱至50，使絕大部分硫酸銨溶解，置室溫過夜，取上清液，用氫氧化銨調pH至7.0。磷酸鹽緩沖溶液（0.01mol/L，pH7.0）（內含0.15mol/L NaCl，簡稱PBS）：取0.2mol/L Na2HPO4溶液30.5mL，0.2mol/L NaH2PO4溶液19.4mL，加NaCl8.5g，加蒸餾水至1000mL。 磷酸緩沖溶液（0.0175mol/L，pH6.7）（不含NaCl，簡稱PB

41、）：取0.2mol/L Na2HPO4溶液43.5mL，0.2mol/L NaH2PO4溶液56.6mL混合，用蒸餾水稀釋至1000mL。2.操作 取家畜血清5mL，加PBS（0.1mol/L，pH7.0）5mL，混勻（取250L至1.5mL離心管中，加PBS 250L，混勻，這500L用于本課程的第三個實驗，注意編號后冷凍保存）。用250L PBS重新補齊10mL，然后，滴加（邊搖邊攪拌）飽和硫酸銨4mL（此時溶液硫酸銨飽和度約為20%）。靜置20min，以3000r/min離心15min，沉淀為纖維蛋白（棄去），上清液中含清蛋白、球蛋白。上清中，再加飽和硫酸銨溶液6mL（方法同前），此時溶

42、液硫酸銨飽和度為50%，靜置20min，以3000r/min離心15min，上清液中含清蛋白，沉淀為球蛋白。一部分組的同學，將沉淀溶于2mL PBS（0.01mol/L pH7.0），編號“總球蛋白”，備用。另一部分組的同學，將沉淀溶于5mL PBS（0.01mol/L pH7.0），加飽和硫酸銨3.2mL，此時溶液硫酸銨的飽和度約為33%，靜置20min，以3000r/min離心15min，除去上清液，沉淀即為“-球蛋白”，該沉淀用2mL PBS溶解。（二）凝膠過濾脫鹽1.試劑 Sephadex G-25：用前要活化和充分溶脹（舊藥品：用50左右的2%氫氧化鈉和0.5mol/L氯化鈉的混合液

43、浸泡若干小時后，再用水洗凈即可。新藥品：以蒸餾水浸泡5h或在沸水浴中溶脹2h即可）；磷酸鹽緩沖液（pH6.7，0.0175mol/L，PB）：見前；磷酸緩沖液（pH7.0，0.01mol/L，PBS）見前；2.操作 取層析柱一根（1.5cm×20cm），垂直于固定架上，夾住流出口。加10mL PB（0.0175mol/L, pH6.7）于柱中。將已溶脹好的Sephadex G-25傾倒去水，加入PB并攪拌成懸浮液，慢慢裝入柱中，打開流出口，繼續(xù)加入Sephadex G-25使自然沉降至15cm高，關閉出口。打開出口，使柱中多余的PB流出凝膠柱床面（切勿低于柱床面）。用吸管吸取鹽析所得

44、的“-球蛋白”溶液2mL，沿管壁加入凝膠面上，打開流出口，讓樣品進入凝膠柱，再用滴管小心加入PB至離凝膠面23cm高，編號，按順序放在試管架上。使用試管分批收集。在收集的同時，使用核酸蛋白檢測儀檢查蛋白質是否流出，并使用記錄儀記錄。將“-球蛋白”的峰對應的試管合并，取500L，編號，冷凍并用于第三個實驗。其它用于DEAE-纖維素52純化。在另一個準備好的Sephadex G-25層析柱中，加入2mL“總球蛋白”樣品，過柱，收集，期間使用記錄儀記錄。收集不同峰對應的試管樣品，按收集時間順序編號（最多-），冷凍并用于第三個實驗。（三）DEAE-纖維素純化IgG1.試劑 DEAE-纖維素：DE-11

45、、DE-22、DE-32、DE-52均可；0.5mol/L HCl溶液；0.5mol/L NaOH溶液；pH6.7，0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液，PB。2.操作 DEAE-纖維素的活化處理 稱取20gDEAE-纖維素，蒸餾水浸泡過夜。次日傾去蒸餾水，加0.5mol/L NaOH溶液100mL，輕輕攪拌。靜置，沉降后倒出NaOH溶液，用蒸餾水洗至pH為8左右，倒出上清液。加0.5mol/L HCl溶液100mL，輕輕攪拌，靜置10min，小心倒出HCl溶液，用蒸餾水洗至pH為6，待用（2014年用過的，不用活化，但要用蒸餾水浸泡過夜）。 裝柱 取層析柱一根（1.5cm×20cm）

46、，按照安裝Sephadex G-25柱的方法裝柱。待纖維素自然沉降后接通洗脫瓶讓PB（pH6.7，0.0175mol/L）流經柱床，待流出液的pH為6.7為止（充分平衡）。 加樣與洗脫 關閉洗脫瓶，讓柱內緩沖液流出至纖維素柱面，關閉流出口，用吸管將已脫鹽的-球蛋白沿柱壁緩緩加入柱內，打開流出口，讓樣品進入柱床（勿使空氣進入）。立即用滴管向柱內沿管壁加入PB至高出柱面2cm，接通洗脫瓶，調整流速至1.5mL/min，按每管1.5mL連續(xù)收集，出現白色沉淀者，核酸蛋白檢測儀檢測出蛋白后，即含有純的IgG，繼續(xù)收集，直至無蛋白流出，直至不發(fā)生白色沉淀反應時為止，合并蛋白管，取500L編號，置冰箱保存

47、，用于第三個實驗。（四）免疫球蛋白G純度的鑒定免疫球蛋白G純度的鑒定辦法很多，最常用的是電泳。免疫電泳、凝膠電泳等都可?？扇苄蕴堑墓枘zG薄層層析一、實驗原理植物組織中的可溶性糖可用一定濃度的乙醇提取出來。經去雜質手續(xù)，除去糖提取液中的蛋白質等干擾測糖的物質，獲得較純的可溶性糖混合液。糖為多羥基化合物，具有較強的極性，在硅膠G薄層層析上展層時，與硅膠分子間有一定吸附力。各種糖羥基多少不同，造成吸附力的差異。該吸附力的大小順序為：三糖二糖己糖戊糖。根據吸附層析原理，極性不同的糖在硅膠G薄層上展層時，具有不同的Rf值。極性越大，Rf值越小。與已知標準糖Rf值比較，可分離鑒定植物樣品提取液中糖的種類。

48、二、材料、儀器和試劑1.材料 蘋果或其他植物材料。2.儀器 （1）離心機及大離心管；（2）臺秤；（3）研缽；（4）蒸發(fā)皿或培養(yǎng)皿；（5）恒溫水??；（6）微量點樣器或毛細管；（7）層析缸；（8）吹風機；（9）玻璃板（15cm×7cm）；（10）涂布器；（11）烘箱；（12）噴霧器。3.試劑 （1）95%乙醇；（2）80%乙醇；（3）10% Pb（Ac）2；（4）飽和Na2SO4；（5）氯仿；（6）冰乙酸；（7）1%標準糖溶液（10mg/ml）：木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖；（8）苯胺-二苯胺-磷酸顯色劑（顯色原理，現用現配）：2g二苯胺，加2ml苯胺，10ml 85%磷酸，1ml濃HCl，

49、100ml丙酮溶后搖勻。三、操作步驟1.硅膠G薄板的制備 稱取硅膠G粉3g，加0.1mol/L 硼酸溶液9ml，于研缽中充分研磨，待硅膠G開始變稠時，傾入涂布器中，可鋪15m×7cm薄板兩塊。鋪層后的薄板放在100烘箱中烘干，取出后放在干燥器中備用；也可在室溫下烘干過夜，用前與110烘箱中活化1h，立即使用。2.蘋果中可溶性糖提取液的制備 取洗凈的蘋果，削皮，稱10g果肉，在研缽中將果肉磨成勻漿，用20ml 95%乙醇分數次洗入大離心管中，浸提30min，3000rpm離心10min,上清液傾入另一大離心管中，殘渣加5ml 80%乙醇洗滌，離心，取上清液，重復二次合并上清液，于70水

50、浴上預熱上清液，趁熱逐滴加入10%中性醋酸鉛溶液，以沉淀蛋白質，然后再逐滴加入飽和硫酸鈉沉淀多余的鉛（嘗試100，10min，不加PbAc2，直接使蛋白變性），30000r/min離心10min。傾出上清液，于70水浴上蒸干，析出物質以2ml蒸餾水溶解，即得糖抽提液。如果蛋白質含量不高，也可省去此步，但要通過預試決定。3.蘋果提取液中可溶性糖的分離鑒定 取活化過的硅膠G玻板一塊。在距離底邊1.5cm水平線上確定5個點，相互間隔1cm，其中4個點分別點上1%的木糖、葡萄糖、果糖和蔗糖標準溶液各3l或適量，另一個點點上蘋果提取液26l或適量。以氯仿+冰乙酸+水=30+35+5為展層劑進行層析。當前

51、沿達距薄層頂端1cm處，停止層析，取出玻板以吹風機吹干（可以？）。然后以苯胺-二苯胺-磷酸噴霧（注意，千萬不要直接對著噴，為什么？），于85烘箱中烘10min，各種糖即顯示出不同顏色（為什么）。與標準糖比較，根據色斑顏色及Rf值即可鑒定出蘋果提取液中所存在的可溶性糖類。第四編 鑒定方法第六章 電泳« 電泳：是帶電顆粒在電場作用下，向著與其電荷相反的電極移動的現象。第一節(jié) 電泳總論電泳三大類：顯微電泳、自由界面電泳、區(qū)帶電泳 影響帶電粒子的泳動速度的因素1. 顆粒的理化性質：靜電荷量，直徑，形狀，在電場中涌動的速度就越快，反之則越慢。2. 電場強度：電場強度，涌動速度，反之越慢。3.溶

52、液的性質： PH：PH離等電點越遠，則其靜電荷量就越大，涌動速度就越快。 離子強度：一般在0.020.2時適中，離子強度過高，涌動速度下降；離子強度過低，也會影響涌動速度。 溶液黏度：泳動速度與黏度成反比。4.電滲：² 顆粒涌動方向與電滲方向一致，涌動速度增加；顆粒涌動方向與電滲方向相反，涌動速度降低。² 當電場力等于或小于電滲力時，顆粒涌動速度為零或向相反方向運動。5.焦耳熱：Q=I²Rt離子強度，電流強度，產熱，對介質和裝置有一定影響，從而改變涌動速度。6.篩孔：篩孔大，涌動速度快。篩孔小，涌動速度慢。第二節(jié) 聚丙烯酰胺凝膠電泳一PAGE的優(yōu)點： 孔徑大小可調

53、節(jié)，對所有蛋白質、肽都有分子篩效應 機械強度好、彈性大 電滲力低 分辨率高 易于重復二. 聚合方法1. 光聚合 催化（引發(fā)）劑 核黃素 適合大孔膠2. 化學聚合 催化（引發(fā)）劑 過硫酸銨 適合小孔膠 三.不連續(xù)凝膠電泳與連續(xù)性凝膠電泳1.連續(xù)與不連續(xù)的區(qū)別：PAGE根據其有無濃縮效應，分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類：² 前者電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷及分子篩效應。² 后者電泳體系中由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應、分子篩效應，還具有濃縮效應，故分離效果更好。2.不連續(xù)性的表

54、現： 膠層不連續(xù)濃縮膠：不考慮分子篩效應，有濃縮效應，PH=6.7-6.8分離膠：不考慮濃縮效應，有分子篩效應和電荷效應。PH=8.8 離子成分不連續(xù) 電位梯度不連續(xù) PH不連續(xù)3. 分離效應 分子篩效應：當大小和形狀不同的蛋白質通過一定孔徑的分離膠時，由于受阻滯的程度不同從而表現出不同遷移率的現象。 電荷效應：各種蛋白質高度濃縮、堆疊于高濃度的區(qū)域內，它們按電荷多少、相對分子質量及形狀，以一定順序排成一條條的區(qū)帶。4. 操作不連續(xù)垂直板PAGE： 膠板模具的裝配： 制備凝膠： 加樣： 電泳： 樣品固定、染色、脫色第三節(jié) 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳之SDSPAGE 一.基本原理1.SDS與巰基乙醇

55、作用 SDS作用：是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質的氫鍵、疏水鍵打開，并結合到蛋白質的疏水部分，形成SDS-蛋白質復合物。 巰基乙醇作用：打開二硫鍵，避免重新氧化。2. 亞基的變化： 電荷變化：亞基表面被SDS覆蓋，使各種蛋白質都帶上相同密度的負電荷，其電荷量遠遠超過了蛋白質原來的電荷，從而掩蓋了不同蛋白質分子原有的電荷差別。 形狀變化：任何形狀蛋白均變?yōu)檩^松散的兩端橢圓的棒狀結構，其寬度基本相同，其長度則與分子質量成正比。所以，各種蛋白質的遷移率不再受電荷量和形狀的影響，而只與其分子量有關。三 具體操作1.裝置電泳系統(tǒng)2.電泳步驟 儀器的組裝；試劑的調配。（eg： Tris-HCl緩沖液，

56、 30%Acr-0.8%Bis儲備液等） 制備分離膠：凝膠濃度（T）是根據待測樣品的分子質量大小來決定。樣品分子質量：35020KDa：T=5%10010KDa：T=10%Tris-HCl緩沖液的配置，Acr：Bis=29：:1（30%Acr-0.8%Bis儲備液）3.制備濃縮膠濃縮膠配好后要快速充分搖勻，并插入梳子，待其聚合凝固。4.加樣5.電泳條件：電極液為0.1%SDS-0.15（或0.005）mol/L Tris-Gly緩沖液（PH8.3），電壓為100V，電泳時間2h左右。（凝膠柱濃度10%）6.固定與染色電泳完畢的凝膠柱在20%磺基水楊酸或10%三氯乙酸溶液浸泡過夜，然后用0.02%0.05%考馬斯亮藍溶液染色20min，取出后脫色2-3次，每次1小時。第三節(jié) 應用實例小牛血清蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳一、實驗目的1. 學習電泳技術的基本原理，掌握電泳實驗技術的操