HPLC法測(cè)定注射用頭孢噻肟鈉的有關(guān)物質(zhì)

1、HPLC法測(cè)定注射用頭孢噻肟鈉的有關(guān)物質(zhì)         【摘要】  改進(jìn)HPLC測(cè)定注射用頭孢噻肟鈉中有關(guān)物質(zhì)的方法。在美國(guó)藥典和歐洲藥典(英國(guó)藥典)方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了兩種不同流動(dòng)相系統(tǒng)，用梯度洗脫對(duì)注射用頭孢噻肟鈉的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了分離。結(jié)果樣品中各成分的分離度及檢出靈敏度完全滿足有關(guān)物質(zhì)限度的測(cè)定要求。改進(jìn)后的RPHPLC方法能更加真實(shí)有效的反映注射用頭孢噻肟鈉的有關(guān)物質(zhì)含量，可有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量。 【關(guān)鍵詞】  頭孢噻肟鈉； 有關(guān)物質(zhì)； 高效液相色譜法   ABSTR

2、ACT  To improve the method for determination of related substances of cefotaxime sodium for injection. On the basis of USP and EP (BP) methods, different mobile phase systems were optimized. Gradient elution was applied on the separation of cefotaxime sodium and its related substances. The reso

3、lution and sensitivity of related substances were acceptable. The detection limit was 100ng. This method was found to be simple and selective. It could be used to control the quality of product effectively.   KEY WORDS  Cefotaxime sodium;  Related substances;  HPLC 

4、0; 注射用頭孢噻肟鈉(cefotaxime sodium)為第三代頭孢菌素，抗菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)，臨床應(yīng)用廣泛1，2。中國(guó)藥典1995年版采用微生物檢定法測(cè)定頭孢噻肟鈉的含量，2000年版修訂為HPLC法，但直到2005年版仍未對(duì)有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行要求。美國(guó)、歐洲和英國(guó)35等各國(guó)藥典對(duì)注射用頭孢噻肟鈉有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法均有收載，且在歐洲藥典中已確證頭孢噻肟鈉中可能存在4個(gè)雜質(zhì)，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)有報(bào)道。為完善我國(guó)藥典收載的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文借鑒美國(guó)藥典、歐洲藥典和英國(guó)藥典的方法，建立切實(shí)可行的控制頭孢噻肟鈉有關(guān)物質(zhì)的方法。    1  儀器與試藥  

5、 1.1  儀器   島津10A高效液相色譜儀(LC10ATvp高壓泵，SIL10ADvp進(jìn)樣器，SPDM10A PDA檢測(cè)器，DGU14A在線脫氣機(jī))；MilliQ純水機(jī)(Millipore公司)。1.2  藥品與試藥   注射用頭孢噻肟鈉(批號(hào)0406132)由哈藥集團(tuán)三精制藥有限公司提供；注射用頭孢噻肟鈉(批號(hào)050103)由浙江亞太藥業(yè)股份有限公司提供；注射用頭孢噻肟鈉(批號(hào)050321025)由蘇州東瑞制藥有限公司提供。甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。    2  方法與結(jié)果

6、0;  2.1  色譜條件   色譜柱為Hypersil Gold(250mm×4.6mm，5m)；檢測(cè)波長(zhǎng)235nm；流速1.0ml/min；進(jìn)樣體積10l。   流動(dòng)相I(梯度洗脫)  流動(dòng)相A為0.05mol/L磷酸鹽緩沖液甲醇(8614)；流動(dòng)相B為0.05mol/L磷酸鹽緩沖液甲醇(6040)。   0.05mol/L磷酸鹽緩沖液的配制  取7.1g磷酸氫二鈉至1000ml量瓶中，加水溶解至接近刻度，用磷酸調(diào)節(jié)溶液pH至6.25，加水定容至1000ml)，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

7、   流動(dòng)相II(等度洗脫)  流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖鹽甲醇(8515)。   2.2  樣品溶液的配制   取頭孢噻肟鈉40mg至50ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻。   2.3  流動(dòng)相I與流動(dòng)相II的比較   (1)分離效果的比較  流動(dòng)相I  流動(dòng)相I系統(tǒng)為美國(guó)藥典分析頭孢噻肟鈉采用的系統(tǒng)。完全按照流動(dòng)相I的梯度洗脫程序，發(fā)現(xiàn)主峰與前后相鄰的雜質(zhì)不能很好的分離。針對(duì)分離情況，將梯度洗脫程序進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整后，調(diào)整后的洗脫程序如表2所示

8、。結(jié)果分離效果較好，主要分離出樣品中含有的12個(gè)雜質(zhì)(圖1)。   流動(dòng)相II為歐洲藥典(英國(guó)藥典)在分析頭孢噻肟鈉采用的系統(tǒng)。完全按照流動(dòng)相II的等度洗脫程序，發(fā)現(xiàn)主峰前分離出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)與流動(dòng)相I的相同，但是主峰后的雜質(zhì)在1h之內(nèi)沒(méi)有出峰。為了縮短分析時(shí)間，將主成分出峰后改為梯度洗脫，樣品色譜圖顯示45min之內(nèi)可以將主峰后的雜質(zhì)完全洗脫，洗脫程序如表3所示，但是色譜基線漂移比較嚴(yán)重(圖2)。   (2)最低檢出限的比較  兩種流動(dòng)相在同一根色譜柱上得出的頭孢噻肟鈉的最低檢出限(以S/N=3表1   流動(dòng)相I梯度洗脫程序

9、計(jì))基本一致，為100ng。   2.4  兩種流動(dòng)相比較結(jié)果小結(jié)   通過(guò)對(duì)流動(dòng)相I和流動(dòng)相II在同一根色譜柱上分離效果及最低檢出限的比較，發(fā)現(xiàn)對(duì)流動(dòng)相比例作適當(dāng)調(diào)整后，流動(dòng)相I和流動(dòng)相II均能檢出相同數(shù)量的雜質(zhì)，分離效果均較好，但是流動(dòng)相II為等度洗脫，主成分后雜質(zhì)的酯溶性較強(qiáng)，若維持原流動(dòng)相中有機(jī)比例不變，主成分后雜質(zhì)在1h內(nèi)不能出峰，將主成分出峰后改為梯度洗脫，增加流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例，可將主峰后雜質(zhì)洗脫，但是相對(duì)于流動(dòng)相I，調(diào)整后流動(dòng)相II的基線漂移幅度較大，且梯度洗脫的流動(dòng)相為純水相和純有機(jī)相，而流動(dòng)相I中兩相流動(dòng)相A和流動(dòng)相B均

10、為加有不同有機(jī)溶劑比例的混合相，有利于色譜條件的穩(wěn)定，同時(shí)兩種方法的最低檢出限基本一致，所以最終采用流動(dòng)相I的洗脫方法進(jìn)行粗放性考察。   2.5  系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)溶液的選擇   美國(guó)藥典中系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)溶液配制  取1ml對(duì)照品溶液加7ml水和2ml甲醇，加25mg碳酸鈉固體混合溶解，室溫放置10min，加3滴冰乙酸，1ml對(duì)照品溶液，混合均勻。            美國(guó)藥典中的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液是頭孢噻肟鈉的堿破壞溶液，而歐洲藥典(英

11、國(guó)藥典)中的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液是頭孢噻肟鈉的酸破壞溶液。從色譜圖可以看出，美國(guó)藥典中的系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)主要產(chǎn)生一個(gè)雜質(zhì)(雜質(zhì)1)，產(chǎn)生的雜質(zhì)數(shù)目較少，而歐洲藥典(英國(guó)藥典)中的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液，產(chǎn)生的雜質(zhì)較多，不僅產(chǎn)生雜質(zhì)1，而且還產(chǎn)生明顯的雜質(zhì)2、雜質(zhì)3和雜質(zhì)4。從樣品的色譜圖可以看出，雜質(zhì)1在多數(shù)樣品中是最大雜質(zhì)，而且樣品中也存在與雜質(zhì)1相鄰的雜質(zhì)2，與主峰相鄰的雜質(zhì)4在樣品中也存在，兩對(duì)雜質(zhì)的分離效果是確定色譜條件的關(guān)鍵，因此雜質(zhì)1和雜質(zhì)2的分離度以及雜質(zhì)4和主峰的分離效果可以充分體現(xiàn)色譜系統(tǒng)的分離效果。所以，采用歐洲藥典(英國(guó)藥典)中的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液更能保證色譜條件的分離效果(圖3)。

12、0;  2.6  方法的粗放性考察   采用另外兩根B型色譜柱和一根A型色譜柱對(duì)方法進(jìn)行粗放性考察。結(jié)果顯示兩種類型色譜柱的分離效果均較好，但是B型色譜柱的色譜峰對(duì)稱性較好(拖尾因子小于1.2)，不拖尾；而A型色譜柱的色譜峰有明顯拖尾(拖尾因子大于1.5)，所以優(yōu)先選擇B型色譜柱(圖4)。   2.7  三批樣品的測(cè)定結(jié)果   對(duì)三批實(shí)際樣品， 采用Hypersil Gold(250mm×   圖3   系統(tǒng)適應(yīng)性溶液及樣品溶液的HPLC色譜圖圖4

13、0;  系統(tǒng)適應(yīng)性溶液在不同類型色譜柱上的HPLC色譜圖   4.6mm，5m)色譜柱進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)測(cè)定，計(jì)算方法采用1%對(duì)照品對(duì)照法，結(jié)果見(jiàn)表4。    3  討論   3.1  色譜柱的選擇性6   A型色譜柱  早期色譜柱，無(wú)定型或球形硅膠，與B型相比，硅膠純度較低，重金屬含量較高，鍵合密度較低，碳載量較低，未采用封尾技術(shù)或不完全封尾技術(shù)，硅羥基活性較高，殘留硅羥基導(dǎo)致的“第二效應(yīng)”較強(qiáng)，能與堿性(含N原子)化合物、酸性化合物發(fā)生氫鍵和離子交換作用，造成色譜峰拖

14、尾，但對(duì)于某些極性化合物，硅羥基是組分分離的主要因素。   B型色譜柱  球型高純硅膠，重金屬含量相對(duì)較低，鍵合密度較高，碳載量較高，采用非極性基團(tuán)封尾技術(shù)(短碳鏈烷基)或其它技術(shù)，使硅羥基活性較低，能改善堿性(含N原子)化合物、酸性化合物的分離。   試驗(yàn)結(jié)果也充分證明B型色譜柱色譜峰的拖尾因子要明顯小于A型色譜柱的色譜峰。   3.2  系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)及梯度洗脫比例的調(diào)整   采用歐洲藥典(英國(guó)藥典)的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液，在調(diào)整后的USP色譜系統(tǒng)的HPLC色譜圖中雜質(zhì)1和雜質(zhì)2的分離度以及雜質(zhì)4

15、和主峰的分離情況可以充分體現(xiàn)出色譜系統(tǒng)的分離效果。采用不同色譜柱進(jìn)行方法粗放性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有些色譜柱需要對(duì)梯度洗脫的表4  三批注射用頭孢噻肟鈉樣品的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果 程序表進(jìn)行一些必要的調(diào)整才能達(dá)到比較好的分離效果。在對(duì)色譜條件的梯度洗脫程序進(jìn)行調(diào)整時(shí)，需要確保雜質(zhì)1和雜質(zhì)2的分離度在1.0以上，雜質(zhì)4和主成分的分離度在1.5以上，以保證色譜的分離能力；此外，根據(jù)文獻(xiàn)7，應(yīng)在頭孢噻肟主峰出峰結(jié)束時(shí)再改換梯度洗脫。   3.3  有關(guān)物質(zhì)的限度   美國(guó)藥典、歐洲藥典(英國(guó)藥典)對(duì)注射用頭孢噻肟鈉有關(guān)物質(zhì)含量的計(jì)算方法均是采用1%對(duì)照品

16、對(duì)照法，但是限度的規(guī)定卻不是一致的。美國(guó)藥典規(guī)定單個(gè)雜質(zhì)不得超過(guò)6.0%，總雜質(zhì)不得過(guò)10.0%；歐洲藥典(英國(guó)藥典)規(guī)定單個(gè)雜質(zhì)不得過(guò)1.0%，總雜質(zhì)不得過(guò)4.0%。三批樣品均符合規(guī)定，提示有關(guān)物質(zhì)的限度以歐洲藥典(英國(guó)藥典)為準(zhǔn)更為妥當(dāng)。    4  結(jié)論   通過(guò)對(duì)美國(guó)藥典、歐洲藥典(英國(guó)藥典)中頭孢噻肟鈉有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法的比較，得出美國(guó)藥典中色譜方法的分離效果和色譜穩(wěn)定性等方面均優(yōu)于歐洲藥典(英國(guó)藥典)的方法。對(duì)美國(guó)藥典方法的粗放性考察，結(jié)果顯示應(yīng)優(yōu)先選擇B型色譜柱。色譜系統(tǒng)的適應(yīng)性溶液采用歐洲藥典(英國(guó)藥典)方法中的酸破壞溶

17、液，以保證色譜條件的分離效果。有關(guān)物質(zhì)的限度，從本文三批樣品的測(cè)定結(jié)果來(lái)看，采用歐洲藥典(英國(guó)藥典)中規(guī)定的限度更適合。【參考文獻(xiàn)】  1 霍天鳳，周棟梁. HPLC測(cè)定注射用頭孢噻肟鈉他唑巴坦鈉的含量及有關(guān)物質(zhì)J. 華西藥學(xué)雜志，2005，20(3)：249251.2 陳吉生. 反相高效液相色譜法測(cè)定頭孢噻肟鈉的含量J. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2000，20(6)：341342.3 The United States Pharmacopoeial Convention Inc. The United States Pharmacopoeia XXIX S. Rochville MD: the United States Pharmacopoeial Convention Inc., 2006:422.4 European Directorate for the Quality of Medicine. The European Pharmacopoeia 5.0 S. Strasbourg, France: the Directorate for the Quali