PCR反應中基本成分的作用

1、PCF反應中基本成分（引物、dNTR模板等）的作用PCR聚合酶鏈式反應）反應包括三個基本步驟，即：模板 DNA的變性、模板DNA 與引物的退火復性、弓I物的延伸。PCF反應體系包括5種基本成分，依次為：引 物、DNA聚合酶、dNTR 模板 DNA Mg2+PCR聚合酶鏈式反應）反應包括三個基本步驟，即：模板 DNA的變性、模板DNA 與引物的退火復性、弓I物的延伸。PCF反應體系包括5種基本成分，依次為：引 物、DNA聚合酶、dNTP 模板 DNA Mg2+1、引物引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板 DNA互補的 程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能

2、按其設計互補的寡核苷酸 鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則：引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn) 非特異條帶。ATGCft好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排 列。 避免引物內部出現(xiàn)二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。 引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對

3、而導致PCF失敗。 引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。 引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量：每條引物的濃度lumol或10100pmol,以最低引物量產(chǎn)生所需要的結果 為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。2、酶目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另 一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCF反應約需酶量（指總反應體積為100ul時），濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。3、dNTPdNTP的質量

4、與濃度和PCF擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當 易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以 IMNaOH 或IMTris。HCL的緩沖液將其PH調節(jié)到，小量分裝，-20C冰凍保存。多次 凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50200umol/L，尤其是注意4 種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時 （偏高或偏低），就會引起錯配。濃度過低又會降低 PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與 Mg2+吉合，使游離的Mg2濃度降低。dNTP儲存液：dNTP溶于pH為的NaOH貯存液中，最初的貯存液可稀釋到10mol/L，

5、分裝后存放在-20C冰箱中。dNTP使用濃度在20200卩mol/L之間。4種dNTP? 必須等濃度配合以減少錯配誤差。dNTP使用濃度：在PCR反應中,使用低dNTP濃度,?可減少非靶位置啟動和延伸 時的核苷酸錯誤摻入。一般可根據(jù)靶序列的長度和組成來決定最低dNTP濃度。例如在100卩1?的反應體系中,4種dNTP的濃度為20卩mol/L,可基本滿足合成 卩g DNA或？10pmol/L? 的400bp序列。使用低dNTP濃度（每種dNTP濃度為 2卩mol/L）,能夠高度靈敏地（1/107）?擴增ras基因點突變的等位基因。4、模板模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一，傳

6、統(tǒng)的DNA屯化方 法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是：溶解細胞膜上 的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS還 能與蛋白質結合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與 DNA吉合的組蛋 白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于 PCR反應。一般臨床檢測標本，可采用快速 簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用于PCF擴增。RNA莫板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶 K法,要防止RNase 降解RNA5、Mg2濃度Mg2+寸PCRT增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP 濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低， 出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反應產(chǎn)物減少。引物是PCR特異性反應的關鍵，不好的引物嚴重影響實驗的質量，好的引物可以 事倍功半;酶的選擇