Western-blot實驗操作步驟

1、Western blot實驗步驟一、制備蛋白樣品（單層貼壁細(xì)胞總蛋白提?。? 倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，加3ml預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，重復(fù)兩次，棄掉PBS后 將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于冰上。2. 裂解液RIPA （強(qiáng)）1ml +PMSF10ul （100:1），兩者混勻后加入培養(yǎng)瓶中裂解細(xì)胞，冰上裂解30min,為使細(xì)胞充分裂解,培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動。3. 裂解完后，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮于一側(cè)（動作要快），轉(zhuǎn)移至ep管中.4.4度，12000rpm,離心5min.離心后取上清至新的ep管中，用于后續(xù) 實驗（-80保存）常用蛋白收樣：倒掉細(xì)胞培養(yǎng)基后，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，棄去，再 加入1ml PBS,用細(xì)胞刮輕輕刮

2、取細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至1.5ml ep管中， 12000rpm,離心5min,盡量吸凈上清，沉淀于-80保存，用于后續(xù)實 驗。融化蛋白樣品，加入RIPA+PMSF細(xì)胞裂解液（200ul/ep管），充 分混勻，冰上裂解20min, 4度離心，5min , 12000rpm,小心吸取上清 至新的ep管中。二、蛋白濃度測定（BCA法）BCA （碧云天）蛋白濃度測定試劑盒靈敏度高，檢測濃度下限達(dá)到25ug/ml ,最小檢測蛋白量達(dá)到0.5ug，待測樣品體積為1-20ul o在50- 2000ug/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA濃度：5mg/ml （20保存），完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取10ul稀釋

3、至100ul ,使終濃度為0.5mg/ml （ug/ul）。蛋白樣品在什么 溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但為了簡便起見，也可以用 09%NaCl或PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。1. 配置BCA工作液A液：B液=50 : 1 ,混勻A液+B液=200ul （每個樣本）樣本數(shù)量：7個標(biāo)準(zhǔn)品+ N個待測蛋白樣本2. 先將每孔加入200ulBCA工作液，再加入蛋白樣本。（96孔板）總體積為10uL待測蛋白樣本先10倍稀釋96孔編號#1#2#3#4#5#6#7BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白Oul1ul2ul4ul6ul8ul10ulddH2O10ul9ul8ul6ul4ul2ulOul96孔待測蛋 白樣本1待測蛋 白樣本2待

4、測蛋白 樣本3待測蛋 白樣本 N10ul/ well3.37度，溫箱中孵育30mino 562nm波長，測OD值。待測蛋白樣品濃度 在50-2000ug/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。4. 根據(jù)所測樣品的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計算樣本相 應(yīng)的蛋白含量，除以樣本稀釋液總體積（10ul ）,再乘以樣本稀釋倍數(shù)， 即為樣本的實際濃度（Ug/ul ）5 蛋白定量后，以最小蛋白濃度為標(biāo)準(zhǔn)，將各組蛋白樣本調(diào)至相同濃度（ddH20 補(bǔ)齊）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：X軸為蛋白質(zhì)量，Y為0D值插入一 XY散點圖，選中圖上一點，右鍵，添加趨勢線一選項（顯示公式，顯示R2, R2>0.99有意義）三、蛋

5、白變性1. 室溫融解SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（漠酚藍(lán)染料）（2x或5x ）2. 將適量蛋白樣本與SDS-PAGE上樣緩沖液混合，使其終濃度為1x3.100度或沸水煮3-5min ,充分變性蛋白。冷卻至室溫后，直接上樣到 SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可?；蚶鋮s后-80保存用于后續(xù)實驗。四、蛋白電泳1. 配膠：根據(jù)配膠試劑盒操作步驟，按照目的蛋白分子量大小，選擇相 應(yīng)濃度的分離膠。配膠時最后加10%過硫酸鞍和TEMED每.板分離膠 5ml,濃縮膠3ml.短板在內(nèi)側(cè)。配好后如暫時不用，可將膠板取下，電 泳液中浸泡，4度保存。2. 配電泳液1x甘氨酸-Tris電泳緩沖液1LTris 3.03g甘

6、氨酸14.4gSDS1g3. 蛋白上樣：樣本10-30ul （保證蛋白質(zhì)量最少為30ug） 20-25ul蛋白 Marker 5ul選擇較好的孔加樣，并記錄加樣位置4. 連接電極，跑電泳：電泳條件80V,30min （藍(lán)色條帶到達(dá)濃縮膠底部）110V,90min （參考Marker的位置，藍(lán)色條帶跑到膠底部即可）五、轉(zhuǎn)膜1 配轉(zhuǎn)膜液：1L Tris 3.03g甘氨酸14.4g,加水至800ml,最后加甲醇200ml,調(diào)至總體積為1L.2. 切膠：起膠時將膠留在長玻璃板上，將裁減好的膜做好標(biāo)記后浸泡在 轉(zhuǎn)膜液中。確定目的蛋白的位置（根據(jù)Marker條帶），切膠，保留目的 蛋白位置，將膜置于膠上，膜數(shù)字面在上，背面與膠相貼，數(shù)字標(biāo)記端貼 在 Marker 上。3. 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜：按如下順序陰極（黑）4. 連接電極，轉(zhuǎn)膜：90V,90min六、封閉1. 配封閉液:0.5g脫脂奶粉+ 10ml PBS2. 取下膜，注意蛋白在膜與膠貼合的一面，取下后將膜有蛋白面朝下, 封閉1小時 七、抗體孵育配抗體稀釋液：0.5g脫脂奶粉，10ul Tween, 10ml PBS配洗膜液：100ul Tween + 100ml PBS一抗孵育，4度過夜次日，洗膜液洗4次，