加味補(bǔ)肝湯對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

1、加味補(bǔ)肝湯對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響 作者：熊麗麗,陳澤奇,黃娟,傅擎宇【摘要】 目的 觀察加味補(bǔ)肝湯對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)表達(dá)的影響,探討其對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變的防治作用。方法 用1%鏈脲佐菌素誘發(fā)糖尿病模型,72 h后尾靜脈采血測(cè)定血糖,凡血糖16.7 mmol/L者納入實(shí)驗(yàn)。造模穩(wěn)定1周后，加味補(bǔ)肝湯組予加味補(bǔ)肝湯灌胃28.6 g/(kg·d),分別于用藥后第4、8周2個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠,用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)坐骨神經(jīng)中BDNF蛋白的表達(dá),通過(guò)Motic Images Advanced彩色圖文分析系統(tǒng)測(cè)定免疫反應(yīng)產(chǎn)物BDN

2、F蛋白的灰度值。結(jié)果 在4、8周模型對(duì)照組坐骨神經(jīng)中BDNF陽(yáng)性的表達(dá)比正常對(duì)照組明顯減少(P0.05),第8周時(shí)BDNF表達(dá)比4周時(shí)增多。經(jīng)加味補(bǔ)肝湯治療后BDNF的陽(yáng)性表達(dá)比模型組表達(dá)明顯增多(P0.05)。結(jié)論 加味補(bǔ)肝湯能上調(diào)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中BDNF的表達(dá),對(duì)糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變有一定的防治作用。 【關(guān)鍵詞】 加味補(bǔ)肝湯；糖尿病周圍神經(jīng)病變；坐骨神經(jīng)；腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子；大鼠Key words：Jiawei Bugan decoction；diabetic peripheral neuropathy；sciatic nerve；brain-derived neurotrophic

3、 factor；rat 神經(jīng)病變是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥,包括周圍神經(jīng)病變和中樞神經(jīng)病變,尤以前者多見(jiàn)1。通過(guò)多年的臨床觀察,加味補(bǔ)肝湯對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)有明顯的療效。前期研究表明,加味補(bǔ)肝湯對(duì)鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的DPN大鼠有減輕病情的作用2。為了進(jìn)一步探討加味補(bǔ)肝湯對(duì)DPN的保護(hù)作用,本研究以STZ誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性DPN模型,研究腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)在糖尿病周圍神經(jīng)病變中的保護(hù)作用。1 實(shí)驗(yàn)材料1.1 動(dòng)物選用健康清潔級(jí)8周雄性Wistar大鼠60只,體質(zhì)量220270 g,上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,許可證號(hào)：SCXK(滬)2003-003。1.2 主要試劑和儀

4、器 Shandon325型石蠟切片機(jī)(英國(guó)Shandon),德國(guó)羅氏公司ACCU-CHEC血糖儀,Motic Images Advanced彩色圖文分析系統(tǒng)(MOTIC CHINA GROUP CO.LTD),STZ(美國(guó)Sigma),兔抗BDNF多克隆抗體、即用型SABC試劑盒(武漢博士德),DAB顯色試劑盒(北京中山生物技術(shù)公司),其他試劑由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院藥房提供。1.3 藥物 加味補(bǔ)肝湯由枸杞15 g、木瓜15 g、當(dāng)歸10 g、川芎10 g、熟地黃12 g、白芍15 g、桑寄生15 g、麥冬15 g、天花粉15 g等組成,以 28.6 g/(kg·d)灌胃(按體表面積計(jì)算7

5、0 kg體質(zhì)量成人臨床用量的等效量)。2 實(shí)驗(yàn)方法2.1 分組及造模 Wistar大鼠60只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,按照SAS統(tǒng)計(jì)軟件包產(chǎn)生的隨機(jī)表,隨機(jī)將大鼠分為正常對(duì)照組20只、模型組20只、加味補(bǔ)肝湯組20只。模型組和加味補(bǔ)肝湯組大鼠禁食12 h后,一次性腹腔注射1%的STZ(50 mg/kg,pH 4.24.5,0.1 mol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液配制)誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型。造模后12 h內(nèi)飲用糖水,隨后飲用自來(lái)水,72 h后尾靜脈采血測(cè)定血糖,凡血糖16.7 mmol/L者納入實(shí)驗(yàn)。正常對(duì)照組20只大鼠禁食12 h后一次性腹腔注射相應(yīng)容積的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液,造模穩(wěn)定1周后加味

6、補(bǔ)肝湯組用中藥加味補(bǔ)肝湯灌胃治療。模型組和正常對(duì)照組則用等體積的蒸餾水灌胃治療,實(shí)驗(yàn)期間自由飲水。用藥后分別于4、8周測(cè)大鼠體質(zhì)量和血糖。2.2 標(biāo)本提取 分別于用藥后第4、8周一次性腹腔注射10%的水合氯醛(350 mg/kg)麻醉,劍突下橫切口,沿膈肌與胸廓交界處剪開膈肌,剪斷兩根肋骨,暴露心臟,用針頭與心尖左緣成45o60o方向向上進(jìn)針,插入升主動(dòng)脈(同時(shí)剪開右心耳)固定針頭,快速滴入37 生理鹽水100 mL,無(wú)血污后改為滴入固定液(4 , 40 g/L多聚甲醛PBS 1 mL/min)250 mL。后俯臥位固定,取左側(cè)梨狀肌下緣坐骨神經(jīng)約1 cm,置于4%多聚甲醛中固定2448 h,

7、常規(guī)脫水,石蠟包埋,連續(xù)切片,片厚約5 m,每隔20張取2張貼于多聚賴氨酸處理的玻片上,烤干后4 保存,留做免疫組化檢測(cè)。2.3 指標(biāo)檢測(cè) 免疫組織化學(xué)檢測(cè)坐骨神經(jīng)內(nèi)BDNF的操作步驟如下：二甲苯常規(guī)脫蠟,100%、95%、80%、70%酒精梯度水化,蒸餾水充分浸洗；3%H2O2-甲醇滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶20 min, 0.01 mol/L PBS(下同)洗5 min/次×3次；EDTA水浴修復(fù)抗原,PBS洗5 min/次×3次；滴加5%BSA封閉液,置濕盒中37 孵育30 min后,甩去多余液體,勿洗；滴加適當(dāng)稀釋的BDNF抗體(工作濃度為1200),置濕盒中37 孵育1

8、 h,4 過(guò)夜；復(fù)溫至37 ,PBS洗5 min/次×3次；滴加生物素化山羊抗兔IgG,37 孵育30 min,PBS洗5 min/次×3次；滴加辣根酶標(biāo)記鏈親合素(SABC),置濕盒中37 孵育30 min,PBS洗5 min/次×3次；DAB顯色,顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,有表達(dá)后蒸餾水洗5 min/次×3次以終止反應(yīng)；70%、80%、95%、100%酒精依次梯度脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。分別以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照,在清晰的背景上出現(xiàn)特異性棕黃色顆粒者為陽(yáng)性,在Motic顯微鏡下照相,用計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)對(duì)免疫組化檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行半定量分析

9、,通過(guò)Motic Images Advanced彩色圖文分析系統(tǒng),測(cè)定免疫反應(yīng)產(chǎn)物BDNF蛋白的灰度值,測(cè)定結(jié)果扣除背底及陰性值,免疫組化產(chǎn)物染色越深,灰度值就越小,抗原物質(zhì)的含量就越高,表達(dá)強(qiáng)度越高。2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件包完成統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量結(jié)果以x±sx±s表示,多組均數(shù)的比較采用方差分析,計(jì)量資料組間差異比較采用q檢驗(yàn),檢驗(yàn)的顯著水平為P0.05。3 結(jié)果3.1 一般狀態(tài)觀察 連續(xù)給藥8周后,正常對(duì)照組大鼠表現(xiàn)為精神狀態(tài)好,體質(zhì)量增加明顯,活動(dòng)自如。模型對(duì)照組在STZ注射72 h后逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿、體質(zhì)量減輕、毛豎無(wú)光澤、蜷臥拱背等

10、糖尿病癥狀。加味補(bǔ)肝湯組也有類似表現(xiàn),但程度較模型組輕。整個(gè)觀察過(guò)程中,正常對(duì)照組無(wú)動(dòng)物死亡,模型組大鼠飼養(yǎng)中有7只死亡,6只為感染所致,另1只死因不明確。加味補(bǔ)肝湯治療組大鼠有6只死亡,均死于感染。死亡大鼠均重新購(gòu)入大鼠,造模,補(bǔ)足各組大鼠數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表1。 表1 各組大鼠體質(zhì)量水平比較(略)注：與同期正常對(duì)照組比較,*P0.053.2 坐骨神經(jīng)形態(tài)結(jié)構(gòu)變化 光鏡下觀察坐骨神經(jīng)病理變化：正常對(duì)照組大鼠坐骨神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常,有完整的結(jié)構(gòu)形態(tài)。模型組出現(xiàn)明顯的損傷反應(yīng),髓鞘空泡變性,結(jié)構(gòu)異常,神經(jīng)纖維變細(xì),部分纖維出現(xiàn)斷裂,朗飛節(jié)之間間隙變寬,部分神經(jīng)組織局部發(fā)生明顯腫脹,雪旺式細(xì)胞

11、增殖,軸突萎縮甚至消失。加味補(bǔ)肝湯組與模型組比較,病變程度減輕。3.3 免疫組化檢測(cè)結(jié)果 BDNF的陽(yáng)性細(xì)胞多分布在坐骨神經(jīng)的中小神經(jīng)元細(xì)胞,神經(jīng)膜和軸突表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性,髓鞘中也有表達(dá)。在第4、8周時(shí)模型組坐骨神經(jīng)纖維中神經(jīng)膜、軸突中BDNF的陽(yáng)性表達(dá)比正常對(duì)照組大鼠減少,但第8周時(shí)BDNF表達(dá)比4周時(shí)增多,經(jīng)圖像分析處理,其平均灰度值與同期正常對(duì)照組比較,P0.05,與同組前一個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較,P0.05。用加味補(bǔ)肝湯治療后,在第4、8周中大鼠坐骨神經(jīng)纖維中神經(jīng)膜、軸突中BDNF的陽(yáng)性表達(dá)隨著治療時(shí)間而增加,其灰度值P0.05。結(jié)果見(jiàn)表2。 表2 各組大鼠坐骨神經(jīng)中BDNF陽(yáng)性產(chǎn)物圖像分析結(jié)果(略)

12、注：與同期正常對(duì)照組比較,*P0.05；與同期模型組比較,#P0.05；與本組前一個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較,P0.054 討論 目前認(rèn)為DPN的機(jī)制十分復(fù)雜,國(guó)外的研究大多集中在糖尿病氧化應(yīng)激上,認(rèn)為氧化應(yīng)激是DPN病變的最后通路。DPN后神經(jīng)再生問(wèn)題成了近年研究的熱點(diǎn),而神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成了熱點(diǎn)中的焦點(diǎn)問(wèn)題。缺乏神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子被認(rèn)為是糖尿病神經(jīng)病變的主要原因3。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是一類在靶組織內(nèi)合成并逆行運(yùn)輸至效應(yīng)神經(jīng)元的,能對(duì)中樞和周圍神經(jīng)發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)作用的小分子肽類物質(zhì)和蛋白質(zhì)。BDNF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中最具代表性的成員之一,他們與神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)有50%同源性,廣泛存在于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中,對(duì)中樞和

13、周圍神經(jīng)組織有廣泛作用,對(duì)神經(jīng)元發(fā)育有促進(jìn)作用,并能使受損神經(jīng)元免于凋亡。 國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道,用外源性的BDNF治療糖尿病db/db小鼠,能明顯減輕體質(zhì)量和降低血糖4,這些研究結(jié)果表明BDNF的減少在DPN發(fā)病中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),高糖條件下,周圍神經(jīng)組織中BDNF蛋白的表達(dá)下降,減弱了受損神經(jīng)纖維的修復(fù)能力,這可能是周圍神經(jīng)功能和結(jié)構(gòu)受損的原因之一。模型組8周時(shí)比4周明顯增多,可能是持續(xù)高糖環(huán)境下BDNF代償性的增加來(lái)保護(hù)神經(jīng)組織。用加味補(bǔ)肝湯治療DPN大鼠后,BDNF蛋白在坐骨神經(jīng)中的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào),并隨著治療的進(jìn)行而增多。 DPN屬中醫(yī)學(xué)“消渴”合并“痹證”、“脈痹”等范疇。其病機(jī)是燥熱

14、亢盛、陰津虧損,調(diào)肝養(yǎng)肝、活血通絡(luò)是治療DPN的主要方法之一。補(bǔ)肝湯出自醫(yī)宗金鑒,是滋養(yǎng)肝血的代表方劑,加味補(bǔ)肝湯是補(bǔ)肝湯加丹參、天花粉等組成。方中熟地黃甘溫,歸經(jīng)肝腎,養(yǎng)血滋陰,為君藥。當(dāng)歸辛苦甘溫,歸經(jīng)入肝,補(bǔ)血活血,為臣藥。佐以白芍,苦酸微寒,養(yǎng)血斂陰；木瓜、甘草酸甘化陰,舒筋活絡(luò)；麥冬、酸棗仁滋養(yǎng)肝陰。使以川芎,辛溫入肝,活血行氣。配桑寄生、枸杞子補(bǔ)腎養(yǎng)肝,丹參活血通絡(luò),天花粉清熱生津、潤(rùn)燥止渴等。全方共奏養(yǎng)肝活血通絡(luò)之功,故能有效改善微循環(huán),增加血流量,上調(diào)相應(yīng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)組織,改善組織的缺血、缺氧,從而能有效地改善DPN的癥狀。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,加味補(bǔ)肝湯可明顯上調(diào)內(nèi)源性B

15、DNF蛋白的表達(dá),其機(jī)制可能與營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)組織,從而改善神經(jīng)組織的缺血、缺氧和組織損傷有關(guān),進(jìn)而對(duì)DPN具有防治作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 JD Curb, BL Rodriguez, RD Abbott, et al. Longitudinal association of vascular and Alzheimers dementias, diabetes, and glucose toleranceJ. Neurology,1999,52：971975.2 葉仁群,陳澤奇,賀鈺磊,等.加味補(bǔ)肝湯對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)NGF表達(dá)的影響J.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2007,30(2)：9094.3 A Nitta, R Murai, N Suzuki, et al. Diabetic neuropathies in brain are induced by de