常用蛋白還原劑和變性劑

1、常用蛋白還原劑1DTT中文名稱為二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，簡(jiǎn)稱為DTT），是蘇糖醇的C-1及C-4位羥基置換成巰基的化合物。在生化反應(yīng)中用做還原劑，愛護(hù)蛋白質(zhì)或酶中的巰基不致氧化而失活。也常用于還原蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵等。DTT是一種小分子有機(jī)還原劑，化學(xué)式為C4H10O2S2。其還原狀態(tài)下為線性分子，被氧化后變?yōu)榘蜴I的六元環(huán)狀結(jié)構(gòu)。二硫蘇糖醇的名字衍生自蘇糖（一種四碳單糖）。DTT的異構(gòu)體為二硫赤糖醇（DTE），即DTT的C3-差向異構(gòu)體。DTT也經(jīng)常被用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原，可用于阻擋蛋白質(zhì)中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵。但DTT往往無(wú)法還原包埋

2、于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部（溶劑不行及）的二硫鍵，這類二硫鍵的還原經(jīng)常需要先將蛋白質(zhì)變性（高溫加熱或加入變性劑，如6M 鹽酸胍、8M 尿素或1% SDS）。反之，依據(jù)DTT存在狀況下，二硫鍵還原速度的不同，可以推斷其包埋程度的深淺。2.-巰基乙醇英文名稱：-Mercaptoethanol，化學(xué)式：HOCH2CH2SH，分子量：78.13，是一種具有特殊臭味的無(wú)色透亮液體，易燃、易溶于水和醇、醚等多種有機(jī)溶劑。-巰基乙醇(又稱為2-巰基乙醇、1-硫代乙二醇、2-羥基乙硫醇、-硫醇代乙醇）是一種有機(jī)化合物，其化學(xué)式為HOCH2CH2SH，英文通用縮寫為ME或-ME。它兼具乙二醇（HOCH2CH2OH）和乙二

3、硫醇（HSCH2CH2SH）的官能團(tuán)，為揮發(fā)性液體，具有較猛烈的刺激性氣味。-ME通常用于二硫鍵的還原，可以作為生物學(xué)試驗(yàn)中的抗氧化劑。它被廣泛使用的緣由是它的羥基使它能夠溶解于水中，并且降低它的揮發(fā)性。由于具有較低的蒸汽壓，它的難聞的狀況比起惡臭的硫醇要好得多。2-巰基乙醇可以打開蛋白質(zhì)中存在的二硫鍵：cysS-Scys+2HOCH2CH2SH2cysSH+ HOCH2CH2S-SCH2CH2OH，二硫鍵被打開后可以使蛋白質(zhì)的四級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞。由于2-巰基乙醇能夠打開蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，它經(jīng)常被用于蛋白質(zhì)分析。而2-巰基乙醇也經(jīng)常被用于愛護(hù)蛋白質(zhì)中自由的半胱氨酸巰基之間不會(huì)錯(cuò)誤形成二硫鍵。作為

4、還原劑，2-巰基乙醇經(jīng)?？梢耘c二硫蘇糖醇（DTT）或三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽（TCEP）互換使用。2-巰基乙醇是少數(shù)幾種被發(fā)覺可以延長(zhǎng)小鼠壽命的化合物。在微克量級(jí)水平上，2-巰基乙醇被觀看到對(duì)試驗(yàn)鼠的生命具有多種可能的正面效應(yīng)。3.TCEP 化學(xué)名稱：三(2-羧乙基)膦；英文名稱：Tris(2-carboxyethyl)phosphine（TCEP）；分子量：250.19。無(wú)色透亮液體，不溶于脂肪烴，微溶于水，溶于醇、酮、酯、醚、苯、甲苯、二甲苯等，能與氯仿及四氯化碳混溶，與醋酸纖維素、硝酸纖維素、醋酸丁酸纖維素、乙基纖維素、聚氯乙烯、酚醛樹脂、聚丙烯酸酯等高聚物相容性好。 TCEP是一種格

5、外有效的硫醇類還原劑，廣泛用作蛋白質(zhì)化學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)爭(zhēng)辯中二硫鍵的定量還原劑。該試劑在水溶液中的穩(wěn)定性和溶解性都很好。在酸性、堿性溶液中的穩(wěn)定性也不錯(cuò)。與其他類別的硫醇類還原劑如DTT相比，TCEP不僅是一種高效的二硫鍵還原劑，而且在某些巰基的交聯(lián)反應(yīng)中不需要除掉。因而在蛋白質(zhì)化學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)爭(zhēng)辯經(jīng)常優(yōu)先選擇TCEP。TCEP在很寬的PH值范圍內(nèi)都可以選擇性定量地還原哪怕水溶性很差的烷基類二硫化合物。通常室溫下反應(yīng)不到5分鐘就可以完成。TCEP沒有難聞的氣味，而且在空氣中不怕氧化。補(bǔ)充： DTT，beta-巰基乙醇，TCEP等是巰基類還原劑。還原劑可以愛護(hù)蛋白質(zhì)上自由的巰基不被氧化，從而避開蛋

6、白質(zhì)的聚集或變性。在結(jié)晶試驗(yàn)中，一般使用的還原劑工作濃度是110 mM。beta-巰基乙醇是上述三種還原劑中還原力量最差的一個(gè)，由于它本身只有一個(gè)巰基。它的效果一般只能維持23天。因此，在試驗(yàn)中要每隔23天補(bǔ)加一次beta-巰基乙醇來(lái)維持它的作用。由于beta-巰基乙醇是揮發(fā)性的，因此，可以在池液中加入beta-巰基乙醇，利用它的揮發(fā)集中到液滴中去。二硫蘇糖醇DTT有兩個(gè)巰基基團(tuán)，其作用能維持37天。DTT的揮發(fā)性不像beta-巰基乙醇那么強(qiáng)，所以使用時(shí)應(yīng)當(dāng)直接加入到懸滴中去。DTT還可以通過(guò)微透析的方法加入。TCEP的還原力量比beta-巰基乙醇和DTT都強(qiáng)，它的作用可以維持23周。TCEP

7、能使結(jié)晶用的緩沖液酸化。與DTT類似，TCEP需要直接加入到懸滴中，因此可以考慮微透析法。beta-巰基乙醇，DTT，和TECP的作用機(jī)制可能不同。像其他添加劑一樣，假如你發(fā)覺一類物質(zhì)對(duì)樣品的穩(wěn)定性和結(jié)晶有利，則可以去篩選這一類物質(zhì)中最適合你的樣品的一種。我們建議是，最好這三種還原劑都嘗試一下，去發(fā)覺最適合的。還原劑可以與金屬離子結(jié)合，金屬離子其被還原，而還原劑的作用被抑制。這就使得用重金屬原子作同晶置換法遇到了麻煩。可以使用EDTA來(lái)避開還原劑被金屬離子抑制。但是，假如金屬離子是你的樣品蛋白維持活性所必需的，就要當(dāng)心使用EDTA了。堿性條件下，beta-巰基乙醇和TECP更穩(wěn)定，效果要好于D

8、TT。酸性條件下，TCEP的穩(wěn)定性也要好過(guò)DTT。DTT可以使Ni被還原，因此在用Ni柱純化His標(biāo)簽的蛋白時(shí)要避開使用DTT，而應(yīng)當(dāng)考慮beta-巰基乙醇和TECP。半胱氨酸也是一種還原劑。在結(jié)晶試驗(yàn)中，半胱氨酸局限性很明顯，那是由于它簡(jiǎn)潔形成六角形的晶體。但是，半胱氨酸是一種有效的添加劑，能帶來(lái)明顯的效果，不過(guò)需要牢記它的局限性。假如預(yù)期到蛋白會(huì)被氧化，從制備樣品開頭就要加入還原劑，并且在整個(gè)流程中要不斷補(bǔ)加保證其效果。在懸滴法中，可以在池液里加入還原劑，利用還原劑的揮發(fā)集中，保證懸滴中還原性的環(huán)境。在確定還原劑和樣品比例時(shí)，需要考慮樣品上自由巰基的數(shù)目和樣品濃度。自由巰基數(shù)目越多，樣品濃

9、度越高，還原劑的用量就越大。含砷化合物與還原劑不能共用。 二甲胂和 二甲胂酸鈉是結(jié)晶中常使用的含砷化合物，它們不能與還原劑共同使用。其他不能與還原劑一起使用的物質(zhì)還包括：硝酸銨，過(guò)氧化氫，高氯酸鉀，硝酸鈉。在使用某種物質(zhì)之前，應(yīng)當(dāng)先查閱Material Safety Data Sheet (MSDS) 。4.SDSSDS是一種陰離子去污劑，它能破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其它物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵。在強(qiáng)還原劑如巰基乙醇或二硫蘇糖醇的存在下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被打開并解聚成多肽鏈。解聚后的蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，復(fù)合物所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量

10、，這就消退了不同蛋白質(zhì)分子之間原有的電荷差異，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在溶液中的外形像一個(gè)長(zhǎng)橢圓棒。SDS-PAGE不僅可以分別鑒定蛋白質(zhì)，而且可以依據(jù)遷移率大小測(cè)定蛋白質(zhì)亞基的分子量。 DTT和巰基乙醇相比，作用相像，但DTT的刺激性氣味要小很多，毒性也比巰基乙醇低很多。而且DTT比巰基乙醇的濃度低7倍時(shí)，兩者效果相近。但DTT價(jià)格略高一些。DTT有兩個(gè)巰基集團(tuán)，巰基乙醇只有一個(gè)巰基集團(tuán)。常用蛋白變性劑鹽酸胍和尿素尿素和鹽酸胍在高濃度(48 mol/L)水溶液時(shí)能斷裂氫鍵，從而使蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度的變性。同事，還可以通過(guò)增大疏水基酸性殘基在水相中的溶解度，降低疏水相互作用。在室溫下46 mol/

11、L尿素和34 mol/L鹽酸胍，可使球狀蛋白質(zhì)從自然狀態(tài)轉(zhuǎn)變至變性狀態(tài)的中點(diǎn)，通常增加變性劑濃度可提高變性程度，通常8 mol/L尿素的變性力量強(qiáng)。一些球狀蛋白質(zhì)，甚至在8 mol/L尿素溶液中也不能完全變性，然而在8 mol/L鹽酸胍溶液中，他們一般以無(wú)規(guī)章卷曲(完全變性)構(gòu)象狀態(tài)存在。尿素和鹽酸胍引起的變性包括兩種機(jī)制：1、變性蛋白質(zhì)能與尿素和鹽酸胍優(yōu)先結(jié)合，形成變性蛋白質(zhì)-變性劑復(fù)合物，當(dāng)復(fù)合物被除去，從而引起ND反應(yīng)平衡向右移動(dòng)。隨著變性劑濃度的著呢國(guó)家，自然狀態(tài)的蛋白質(zhì)不斷轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)合物，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)完全變性。然而，由于變性劑與變性蛋白的結(jié)合是格外弱的。因此，只有高濃度的變性劑才能引起蛋白質(zhì)完全變性；2、尿素與鹽酸胍對(duì)誰(shuí)說(shuō)氨基酸殘基的增溶作用。由于尿素和鹽酸胍都具有形成氫鍵的力量，當(dāng)他們?cè)诟邼舛葧r(shí)，可以破壞水的氫鍵結(jié)構(gòu)，結(jié)果尿素和鹽酸胍就成為非極性殘基的較好溶