cDNA文庫構建策略及其分析研究進展

1、自20世紀70年代中期首例 cDNA 克隆問世以來，構建 cDNA 文庫已成為研究功能基因組學的基本手段之一。cDNA 便于克隆和大量表達，它不像基因組含有內含子而難于表達，因此可以從 cDNA 文庫中篩選到所需的目的基因，并直接用于該目的基因的表達。通過構建 cDNA 表達文庫不僅可保護瀕危珍惜生物資源，而且可以提供構建分子標記連鎖圖譜的所用探針，更重要的是可以用于分離全長基因進而開展基因功能研究。因此，cDNA 在研究具體某類特定細胞中基因組的表達狀態(tài)及表達基因的功能鑒定方便具有特殊的優(yōu)勢，從而使它在個體發(fā)育、細胞分化、細胞周期調控、細胞衰老和死亡調控等生命現(xiàn)象的研究中具有更為廣泛的應用價

2、值，是研究工作中最常使用到的基因文庫。 從1976年 HOFSTETTER 成功的構建了第一個 cDNA 文庫以來，構建 cDNA 文庫的技術方法經歷了一個逐步發(fā)展完善的過程。初期 cDNA 文庫，由于當時技術的限制，選用質粒載體存在著連接效率低、難以擴增和保存等缺點，而 YOUNG 和 DAVIS 重組載體為表達性文庫構建和保存提供了質的飛躍。近年來，cDNA 文庫構建的新方法層出不窮，但其共同目的是使 cDNA 文庫更加迅速、高效滿足研究的需要。本文就近年來發(fā)展的 cDNA 文庫的構建及其類型特點作一簡要綜述。 1 cDNA 文庫的構建 1.1 cDNA 文庫構建的基本原理與方法 cDNA

3、 文庫是指某生物某發(fā)育時期所轉錄的全部 mRNA 經反轉錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經典 cDNA 文庫構建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆轉錄引物，或者用隨機引物，給所合成的 cDNA 加上適當?shù)倪B接接頭，連接到適當?shù)妮d體中獲得文庫。其基本步驟包括：RNA 的提取(例如異硫氰酸胍法，鹽酸胍有機溶劑法，熱酚法等等，提取方法的選擇主要根據(jù)不同的樣品而定)，要構建一個高質量的 cDNA 文庫，獲得高質量的 mRNA 是至關重要的，所以處理 mRNA 樣品時必須仔細小心。由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗諸如煮沸這樣的物理環(huán)境，因此建立一個無 RNA

4、酶的環(huán)境對于制備優(yōu)質 RNA 很重要。在獲得高質量的 mRNA 后，用反轉錄酶 Oligo(dT) 引導下合成 cDNA 第1鏈， cDNA 第2鏈的合成(用 RNA 酶 H 和大腸桿菌 DNA 聚合酶 I，同時包括使用 T4 噬菌體多核苷酸酶和大腸桿菌 DNA 連接酶進行的修復反應)，合成接頭的加入、將雙鏈 DNA 克隆到載體中去、分析 cDNA 插入片斷，擴增 cDNA 文庫、對建立的 cDNA 文庫進行鑒定。這里強調的是對載體的選擇，常規(guī)用的是 噬菌體，這是因為 DNA 兩端具有由12個核苷酸的粘性末端，可用來構建柯斯質粒，這種質粒能容納大片段的外源 DNA。 1.2 cDNA 全長文庫

5、 經典 cDNA 文庫的構建雖然高效、簡便，但文庫克隆的片段一般較小，單個克隆上的 DNA 片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要幾個克隆才能覆蓋一個完整的全基因的 cDNA。為了克隆到真正的 cDNA 全長，建立富含全長的 cDNA 文庫具有重要意義。為此，必須克服僅用 mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆轉錄酶作用特點所導致的局限性。全長 cDNA 文庫，是指從生物體內一套完整的 mRNA 分子經反轉錄而得到的 DNA 分子群體，是 mRNA 分子群的一個完整的拷貝。全長 cDNA 文庫不僅能提供完整的 mRNA 信息，而且可以通過基因序列比對得到 mRNA 剪接信息，此外，還

6、可以對蛋白質序列進行預測及進行體外表達和通過反向遺傳學研究基因的功能等。目前所報道的對全長文庫的構建一般按照美國 CLONTECH 公司的 SMART cDNA Library Construction Kit 方法或 GeneRacer 試劑盒 (Invitrogen，USA) 使用說明進行。判斷一個 cDNA 文庫中的 cDNA 序列是否是全長基因的 cDNA，主要方法有以下幾種。 1.2.1 直接從序列上評價 5'端：如果有同源全長基因的比較，可以通過與其它生物已知的對應基因5'末端進行比較來判斷。如果無同源基因的新基因，則首先判斷編碼框架是否完整，即在開放閱讀框的第1個

7、 ATG 上游有無同框架的終止密碼子；其次，判斷是否有轉錄起始點，一般加在5'帽結構后有一段富含嘧啶的區(qū)域，或者是 cDNA 5'序列與基因組序列中經過酶切保護的部分相同，則可以確定得到的 cDNA 的5'端是完整的。3'端：同樣可以用其它生物已知的對應基因3'末端進行比較來判斷，或編碼框架的下游有終止密碼子，或有1個以上的 PolyA 加尾信號，或無明顯加尾信號的則也有 PolyA 尾。 1.2.2 用實驗方法證實 可以通過引物延伸法確定5'端和3'端的長度，如：5'端 RACE，3'端 RACE，或者通過 Northe

8、rn Blot 證實大小是否一致。 1.3 對 cDNA 文庫的分析 對 cDNA 文庫質量的評價主要有兩個方面。第一方面為文庫的代表性，cDNA 文庫的代表性是指文庫中包含的重組 cDNA 分子反映來源細胞中表達信息(即 mRNA 種類)的完整性，它是體現(xiàn)文庫質量的最重要指標。文庫的代表性好壞可用文庫的庫容量來衡量，它是指構建的原始 cDNA 文庫中所包含的獨立的重組子克隆數(shù)。庫容量取決于來源細胞中表達出的 mRNA 種類和每種 mRNA 序列的拷貝數(shù)，1個正常細胞含1000030000種不同的 mRNA，按豐度可分為低豐度、中豐度和高豐度三種，其中低豐度 mRNA 是指某一種在細胞總計數(shù)群

9、中所占比例少于0.5時。滿足最低要求的 cDNA 文庫的庫容量可以用 Clack-Carbor 公式 N=Ln(1-P)/(1-1/n) 計算( P 為文庫中任何一種 mRNA 序列信息的概率，通常設為99；N 為文庫中以 P 概率出現(xiàn)細胞中任何一種 mRNA 序列理論上應具有的最少重組子克隆數(shù)；n 為細胞中最稀少的 mRNA 序列的拷貝數(shù)；T 為細胞中表達出的所有 mRNA 的總拷貝數(shù))。第二方面是重組 cDNA 片段的序列完整性。在細胞中表達出的各種 mRNA 片段的序列完整性。在細胞中表達出的各種 mRNA 盡管具體序列不同，但基本上都是由3部分組成，即5'端非翻譯區(qū)，中間的編碼

10、區(qū)和3'端非翻譯區(qū)。非翻譯區(qū)的序列特征對基因的表達具有重要的調控作用，編碼序列則是合成基因產物蛋白質模板。因此，要從文庫中分離獲得目的基因完整的序列和功能信息，要求文庫中的重組 cDNA 片段足夠長以便盡可能地反應出天然基因的結構。 2 cDNA 文庫構建的其它類型 2.1 均一化 cDNA 文庫 它是指某一特定組織或細胞的所有表達基因均包含其中，且在 cDNA 文庫中表達基因對應的 cDNA 的拷貝數(shù)相等或接近。WEISSMAN 早就提出了可以通過基因組 DNA 飽和雜交的原理將 cDNA 文庫進行均一化的理論。但該理論一直以來都被認為不能應用于實際。其主要限制因素是難以提供足量的極

11、低表達豐度的 cDNA 用于飽和雜交，從而可能會造成部分基因的 cDNA 的丟失。20年前，基于 DNA-RNA 雜交的研究就已經將基因的轉錄水平分為高中低3類。隨后研究進一步表明，絕大多數(shù)基因是處于中等或低等表達豐度的，在單個細胞中含有近115個拷貝，而高豐度表達基因的轉錄產物在單個細胞中最高可達5000個左右拷貝，約占總表達量的25。這種基因表達能力上的巨大差異成了獲得一個具有完整代表性的 cDNA 文庫的障礙，其表達量上的巨大差異更為大規(guī)模研究增添了困難。對單一組織的 cDNA 文庫而言，高拷貝基因序列的大量存在給基因的篩選和鑒定帶來不必要的浪費，尤其是在大規(guī)模的 EST 測序中。 均一

12、化 cDNA 文庫是克服基因轉錄水平上巨大差異給文庫篩選和分析帶來障礙的有效措施，有利于研究基因的表達和序列分析?，F(xiàn)在，在構建均一化的 cDNA 文庫中至少有2種主要的觀點：一種是基于復性動力學的原理，高豐度的 cDNA 在退火條件下復性的速度快，而低豐度的 cDNA 復性要很長時間，從而可以通過控制復性時間來降低豐度；另一種是基于基因組 DNA 在拷貝數(shù)上具有相對均一化的性質，通過 cDNA 與基因組 DNA 飽和雜交而降低在文庫中高拷貝存在的 cDNA 的豐度。第一種方法的掌握對技術的要求比較高，對多數(shù)人而言需要多次摸索才能找到最適條件；而后一種方法易于掌握，但有研究者根據(jù)復性動力學的原理

13、也提出了其不利因素，即采用基因組 DNA 飽和雜交的方法會因為低拷貝的表達基因拷貝數(shù)少而無法被雜交上。目前已報到的均一化 cDNA 文庫多是根據(jù)第二種原理構建的，常用策略有基于 PCR 技術利用 cDNA 多次復性 mRNA-cDNA 雜交等。有研究報道，針對各自選擇的高表達靶序列進行分析后，均一化處理后文庫的高豐度表達 cDNA 是處理前的0.32.5，基本滿足節(jié)約篩選的要求。 均一化 cDNA 文庫具有以下4方面的優(yōu)點：第一，在經濟上具有廣泛的應用空間，可以節(jié)約大量試驗成本。第二，增加克隆低豐度 mRNA 的機會，適用于分析各種發(fā)育階段或各種組織的基因表達及突變檢測。第三，與原始豐度的 m

14、RNA 拷貝數(shù)相對應的 cDNA 探針與均一化的 cDNA 文庫作雜交，可以估計出大多數(shù)基因的表達水平及發(fā)現(xiàn)一些組織特異的基因。而以往的文庫構建，忽略了 mRNA 豐度的影響。第四，可以用于遺傳圖譜的制作和進行大規(guī)模的原位雜交，作為優(yōu)化的文庫系統(tǒng)還可以用于大規(guī)模的測序或芯片制作等研究。 2.2 差減 cDNA 文庫 (Subtractive cDNA library) 差減文庫也稱扣除文庫，使用兩種遺傳背景相同或大致相同但在個別功能或特性上不同的材料(如不同基因處理細胞系或植物的近等基因系等)提取 mRNA (或反轉錄后合成 cDNA)，在一定條件下用大大過量不含目的基因的一方作為驅動子( D

15、river )與含有目的基因的試驗方( Tester )進行雜交，選擇性的祛除兩部分共同基因雜交形成的復合物，往往進行多次的雜交祛除過程，最后將含有相關目的基因的未雜交部分收集后，并連接到載體形成文庫。消減雜交是構建差減 cDNA 文庫的核心，差減文庫是否構建成功很大程度上決定于差減雜交的效率。差減雜交的方法主要有(1)羥基磷灰石柱層析法 (HAP)；(2)生物素標記、鏈親和蛋白結合排除法；(3)限制性內切酶技術相結合的差減方法；(4)差減抑制雜交法 (SSH)；(5)磁珠介導的差減法 (MAST)，其中 SSH 法最為常用。 抑制性消減雜交技術 (Suppression Subtractiv

16、e Hybridization，SSH) 是 DIATCHENKO 等人于1996年依據(jù)消減雜交和抑制 PCR 發(fā)展出來的一種分離差異表達基因的新方法，主要用于分離兩種細胞或兩種組織的細胞中的差異表達基因。它主要是利用抑制 PCR 對差減雜交后豐度一致的目的材料中兩端連有不同接頭的差異表達片段進行指數(shù)擴增，而兩端連接上同一接頭的同源雙鏈片段僅呈線形擴增，從而達到富集差異表達基因的目的。因此應用該技術能夠對兩個有差異表達的材料(細胞或組織)高、中、低豐度目的基因都進行有效、快速、簡便克隆。近年來已成功應用于植物發(fā)育、腫瘤與疾病、以及外界因子誘導組織細胞中相關的應答基因的分析和克隆。 2.3 固相

17、 cDNA 文庫構建 cDNA 的固相合成是人們早為熟知的技術，但局限之處 oligo(dT) 與纖維素膠?；虼胖榈慕Y合比較牢固，將 cDNA 洗脫下來時得率不是很高，而且以后的反應步驟也不能都在介質上進行，這可能是該技術應用并不十分廣泛的原因。 最近 THOMAS ROEDE 提出了一種新的 cDNA 文庫固相合成方法( THOMAS ROEDE，1998)，克服了以前文庫構建中存在的缺點，所用的酶和試劑與傳統(tǒng)方法完全相同，不同的是 cDNA 的合成和修飾均在固相支持物磁珠上完成。cDNA 通過一個生物素固定在鏈霉素偶聯(lián)的磁珠上，這樣在反應過程中就可以簡便而迅速的實現(xiàn)酶和緩沖液的更換，因此它

18、將快速與高質量的文庫構建結合在一起(構建文庫只需1 d)，并且構建的文庫適合大多數(shù)的研究目的。 固相 cDNA 合成法的主要優(yōu)點是可以簡便 cDNA 合成的操作。在進行緩沖液更換時既沒有 cDNA 的丟失之憂，也無其它物質污染之憂。另外，用此方法可以得到真實的代表性文庫，它包含有短小的 cDNA，這是因為在克隆之前省去了分級分離的步驟?？傊?，固相法結合了傳統(tǒng)的 cDNA 合成的優(yōu)點并彌補了其不足。這種方法簡便易行，可靠低廉，所建文庫高質量，因此它可能會替代目前應用的 cDNA 文庫操作方法。 另外，最近發(fā)展起來的微量 RNA 的 cDNA 構建，是使用 PCR 技術，在實驗室條件下擴增的 mR

19、NA 的 cDNA 量，其 PCR 檢測的靈敏度遠遠大于反轉錄 PCR(RT-PCR) 法。微量 RNA 的 cDNA PCR 文庫的構建可為有關微量活性物質遺傳基因的研究提供方便。 3 cDNA 文庫應用于分離新基因的方法 發(fā)現(xiàn)并分離克隆新基因始終是分子生物學研究的主要任務和目的，雖然 cDNA 文庫的用途很多，但是，應用于分離新基因是其最重要的用途。前述的不管是哪種類型的 cDNA 文庫，都可以用于分離新基因，只是使用的方法有差異。分離方法主要有兩種：第一，對于非全長 cDNA 文庫，即不管是經典的 cDNA 文庫方法或差減法構建的 cDNA 文庫，需要利用已經獲得的新 cDNA 序列片段

20、，通過 RACE 方法獲得新基因的全長序列。第二，利用全長 cDNA 文庫與目的基因片段作為探針的雜交篩選。 3.1 從非全長 cDNA 文庫中篩選新基因 3.1.1 RACE 法 RACE 文庫即快速擴增 cDNA 末端法( Rapid Amplification of cDNA End，RACE )只需知道 mRNA 內很短的一段序列即可擴增出其 cDNA 的5'(5' RACE )和3'端(3' RACE )。該法的主要特是利用一條根據(jù)已知序列設計的特異性引物和一條與 mRNA 的 PolyA (3' RACE )或加至第一鏈 cDNA 3'

21、;端的同聚尾(5' RACE )互補的通用引物，由于同聚體并非良好的 PCR 引物，同時為了便于 RACE 產物的克隆，可向同聚體引物的5'端內加入一內切酶位點。所用的 cDNA 模板可以使用多聚 dT 引物延伸合成(3'，5'-RACE 均可)。當 RACE PCR 產物為復雜的混合物時，可取部分產物作模板，用另一條位于原引物內側的序列作為引物與通用引物配對進行另一輪 PCR (巢式 PCR )。早在1988年，F(xiàn)ROHMAN 等即用此方法成功地獲得了4種 mRNA 的5'合3'末端序列。 迄今已有幾種改良的 RACE 方法，通過修飾與優(yōu)化，與

22、最初的 FROHMAN 報道有所不同：(1) BARSON 等采用鎖定寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸引物“鎖定”基因特異性序列的3'末端與其 Poly (A) 尾的連接處，進行第1條 cDNA 鏈的合成，消除了在合成第1條 cDNA 鏈時寡聚 (dT) RNA 模板 Poly (A) 尾任何部位結合而帶來的影響。(2) EDWARDS 和 TROUTT 小組利用 T4 RNA 連接酶把寡核苷酸連接到單鏈 cDNA 的5'末端，然后用一個3'末端特異性引物和一個錨定引物就可以直接對錨定連接的 cDNA 進行體外 PCR 擴增和克隆。隨后，BERTLING 等又用 DNA 連接酶代

23、替 RNA 連接酶。這些方法都避免了在第2條 cDNA 鏈內同聚序列區(qū)互補而導致截斷 cDNA 的產生。(3) MARUYAMA 等提出 cRACE 法，采用的引物為基因特異性的，所以非特異性 PCR 產物基本上不會產生。Clontech 等公司也根據(jù) RACE 法的更新，相繼推出了 RACE 的相應試劑盒，為克隆 cDNA 提供了方便的工具。最近 HUANG 等人即用 RACE 試劑盒克隆了一種含有類植物血凝素免疫受體 ITIM。 3.1.2 用 PCR 法從 cDNA 文庫中快速克隆基因 通過對文庫的篩選或適用簡并引物進行 PCR 反應，常常只能獲得不完整的 cDNA 片段。為了得到 cD

24、NA 全長，常常要重新篩選文庫。重新篩選文庫工作量大，RACE 雖然為此提供可方便，但應用該方法需重新提取 mRNA 和反轉錄。而用 PCR 法從 cDNA 文庫中快速克隆基因的方法，只需提取 噬菌體 DNA，按保守序列設計 PCR 引物便可將未知片段進行克隆。特別是在基因的兩端變異較大而中間某區(qū)域保守的情況下，用 PCR 法很容易獲取 cDNA 的全長。同一轉錄產物，又是存在著不同的拼接方式，通過篩庫的辦法同時將不同拼接方式的克隆篩選出來可能性較小，而使用 PCR 擴增后，有利于觀察到不同的拼接方式。另外，為研究基因在不同組織中表達情況，常根據(jù)差異顯示法找出特異的 mRNA。 3.2 從全長 cDNA 文庫中進行雜交篩選 3.2.1 標記探針 cDNA 文庫篩選法 cDNA 文庫通常涂抹到母盤培養(yǎng)基上，然后再把這些菌落的樣品吸印到硝酸纖維素膜或尼龍膜上；這時加入標記的探針，如果出現(xiàn)雜交信號，那么從母盤上就可以把包含雜交信號的菌落分離、培養(yǎng)出來。以此篩選出陽性克隆，進行序列分析，以獲得 cDNA 全長。該方法能避免 PCR 擴增的非特異性擴增或錯配，是一種比較準確可靠的 cDNA 克隆方法。主要缺點是克隆過程需要一系列的酶促反應、產